Method Article
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
単一分子顕微鏡は、これらの側面( 例えば 、動力学、異なる状態や集団、一時的な相互作用の共存)は、一般的にアンサンブル測定で隠されている、などに関して、特に、シグナル伝達分子の挙動を解析するための強力なアプローチとして浮上している標準的な生化学的または顕微鏡の方法で得られたもの。従って、このような受容体 - 受容体相互作用などの動的イベントは、高時空間解像度で生細胞におけるリアルタイムで追跡することができる。このプロトコルは、小さくて明るい有機蛍光団と直接生きた細胞の表面上の単一の受容体を可視化する全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた標識に基づく方法について説明します。このアプローチは、いずれかが正確に、受容体を局在化受容体複合体のサイズを測定し、そのような一過性受容体 - 受容体相互作用などの動的イベントをキャプチャすることを可能にする。プロトコルは、PE方法の詳細な説明を提供しています試料調製、画像取得および画像解析を含む単一分子実験を、rform。一例として、2つのG-タンパク質共役受容体を分析するこの方法の適用、 すなわち 、β2 -アドレナリン及びγ-アミノ酪酸タイプB(GABA B)は受容体が報告されている。プロトコルは、他の膜タンパク質および異なる細胞モデル、トランスフェクション法および標識戦略に適合させることができる。
受容体は、細胞表面感覚細胞外環境に位置しており、このような臭気物質、イオン、小神経伝達物質および大きいタンパク質ホルモンのような様々な刺激に応答する。細胞膜の流動性は、受容体及び他の膜タンパク質の移動を可能にする。これは、タンパク質複合体およびそのような機能単位にアセンブルし、細胞内部にシグナルを伝達する受容体によって使用されるような一過性のタンパク質 - タンパク質相互作用の発生の形成に必須である。例えば、細胞表面受容体1の最も大きなファミリーを構成するG-タンパク質共役受容体(GPCR)は、シグナル伝達の微調整調節に関与することが表示され、di-/oligomersを形成することが示唆されている重要な生理的および薬理学的結果2-5があるかもしれません。
単一分子顕微鏡で直接高spatiotempで可視化する大きな可能性を秘めている経口解像度の関連付けを含む生きている細胞の表面上に位置する個々の受容体の動的挙動は、二量体およびより高次の分子複合体6-10を形成する。これは通常、分子の数千から数百万の平均的挙動を報告し、標準的な生化学的および顕微鏡の方法に比べていくつかの利点を提供しています。
十分に明るく、光安定性、フルオロフォアとタンパク質標識は、単一分子顕微鏡検査のために不可欠です。このプロトコルは、共有結合し、細胞表面の受容体に小さな、明るい有機蛍光団を接続するために最近導入され、SNAPタグ11を利用しています。 SNAPは、不可逆的に蛍光団結合ベンジルグアニン(BG-フルオロフォア)誘導体で標識することができるヒトDNA修復酵素のO 6 -アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼに由来する20 kDのタンパク質タグである。 CLIP、SNAPに由来し、さらに設計タグは、代わりに蛍光団-Cで標識することができるonjugatedベンジルシトシン誘導体12。
本稿で報告されたプロトコルは、トランスフェクトし、ラベルの小さい有機蛍光団との11の受容体をSNAP-タグおよび生細胞10の表面上の単一の受容体または受容体複合体を視覚化するために全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用する方法について説明します。細胞外SNAP-タグ化細胞表面タンパク質10の> 90%の標識効率の報告されたプロトコールをもたらす。受容体複合体のサイズおよび移動度を分析するために、ならびに一過性受容体 - 受容体相互作用を捕捉するために単一分子データを使用する方法に関するさらなる情報は、提供される。プロトコル全体の概略的なワークフローは、 図1に示されている。一例として、SNAP-タグ化Gタンパク質共役受容体(GPCR)を有するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のトランスフェクションは、フルオロフォア-BG誘導体で標識し、続いてよくquantifへの応用として、yおよびモニタ受容体di-/oligomerizationが記載されている。このプロトコルは、他の細胞表面タンパク質と蛍光タグ( 例えば 、CLIP)、ならびに他のトランスフェクションおよび標識方法にまで拡張することができる。
1。サンプルの調製
2画像の取得
注:全反射蛍光を使用してください(TIRF)顕微鏡、油浸高開口数の対物レンズ( 例えば 、100X magnification/1.46開口数)を装備した、適切なレーザ(例えば405nm、488nmの、561 nmおよび645ナノメートルダイオードレーザ)、電子増倍電荷結合素子(EMCCD)カメラ、インキュベーター、単一蛍光分子を可視化する温度制御。
3。キャリブレーション(ガラス及び単量体/二量体受容体のコントロールにシングルフルオロフォア)
4。画像解析
記載されたプロトコルは、異なる膜タンパク質の種々に適用することができる。例として、β2 -アドレナリン作動性およびGABA B受容体を用いて得られた代表的な結果を10で報告されている。単一分子からの蛍光シグナルが弱いので、バックグラウンド蛍光の最小化が成功した結果の最初の重要なステップである。これにより、広範囲にカバースリップを洗浄( 図2A)を使用すること、ならびに試料の自己蛍光( 例えば 、フェノールレッドを含まない培地を使用することによって)を最小化することが重要である。次のステップは、単一のフルオロフォア分子の蛍光強度を決定することである。これは、清浄なカバーガラス( 図2B)上にスポットし、単一のフルオロフォアを撮像することによって行うことができる。典型的には、フルオロフォアの連続希釈は、分析のための最良の条件を選択するために使用される、すなわち 、十分に分離され、均一に分布し、単一のフルオロフォアを生じる濃度。追加CONTROLSが単量体制御タンパク質を撮像することにより行うことができる、 例えば 、フルオロフォア-BG誘導体で標識されたNAP-標識CD86受容体。これらの予備的なコントロールやキャリブレーションが実行された後は、実際の実験を開始することができます。 図3(a)は、2 -アドレナリン受容体βSNAP-タグおよび蛍光団-BG誘導体で標識されたトランスフェクトされた細胞の典型的なTIRF画像シーケンスの最初のフレームが表示されます。スポットは、単一の受容体または受容体複合体を表す。 、我々の経験によると貧弱な追跡品質が0.45個/μm2の結果上記の密度と10を避けるべきである。図3(b)は、検出アルゴリズムの結果が同じに適用される番組-この画像はまた、自動検出および追跡するのに適した粒子密度を示しています。画像シーケンス。各青い円が検出された粒子を示している。追跡アルゴリズムの結果は、 図3Cに報告されている青色のスプラインは、個々の粒子の軌跡を表す。各粒子の軌道は、次に、それらの拡散係数を計算するために使用することができる。この方法はまた、2つの粒子は、明らかに、過渡的相互作用を受け、図3(d)に示すように、動的なイベントを捕捉することができる。 図4は、 すなわち 、2つの異なったGPCRについて測定拡散係数の分布を示し、β2 -アドレナリン作動性及びGABA B受容体。このタイプの分析は、私たちはGABA B受容体の大部分は不動であるか、または非常に低い移動度10を有していることを示すことができた。混合ガウスフィッティング及びステップフィッティングの分析は、生きている細胞の表面上の受容体複合体の大きさを正確に定量化( 図5)を提供する。 図5Aの例に示すように、この分析は、複雑な分布は、 例えば 、単量体および二量体の共存を明らかにすることができる。図5Bおよび5Cは、1つまたは2つのステップと正確にはそれぞれ、単量体および二量体の受容体としてそれらを割り当てられた対応するステップフィッティング分析において漂白粒子の2つの例を提供する。
図1。このプロトコルで説明するように、典型的な単一分子実験のワークフロー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2カバースリップ洗浄及びキャリブレーションサンプルの調製(A)広範なカバースリップ洗浄前後のバックグラウンド蛍光との比較。カバーガラスを全反射顕微鏡で画像化した。きれいにカバースリップ上にスポットし、フルオロフォア-BG誘導体の濃度を増加させ(B)のTIRF画像を。スケールバー:10μmのは、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。代表的な単一分子の画像および検出/追跡アルゴリズムの結果。 (A)2 -アドレナリン受容体βSNAP-タグおよびBGのフルオロフォアで標識された誘導体でトランスフェクトされたCHO細胞を、TIRF顕微鏡で可視化した。取得された画像シーケンスの最初のフレームが示されている。スケールバー:5μmの(B)。0;検出された粒子は、原画像の上に青い円で示されている(C)は 、同じ画像シーケンスの追跡アルゴリズムの適用から得られた軌道が白地に示されている。スナップショットは、フレームなしの状況に対応しています。 35。グリーンセグメント、イベントをマージする。赤色セグメント分割イベント(D)は、2つの受容体から得られた代表的な粒子軌道は(青および緑のそれぞれ)、見かけの一過性の相互作用(赤色)を受けている。 2つの粒子は、いくつかのフレームのために一緒に移動し、マージして、再度分割します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
受容体mobiliの図4。分析ティ。個々の粒子の軌道は、それらの拡散係数を計算するために使用される。この例では、2つの異なるGPCRを算出するための拡散係数の分布が報告されている。 GABA B受容体は移動性を制限しているのに対し、β2 -アドレナリン受容体は、細胞表面上の速い横方向拡散によって特徴付けられる。 Calebiro、D. ら 10から変更
図5受容体複合体の大きさの分析。 (A)受容体複合体のサイズを正確にガウスの混合モデルを用いて粒子強度の分布を当てはめることによって推定することができる。報告された例は、2 - drenergic受容体βSNAP-タグを発現する細胞に、この分析の適用を示す。フィッティングは2℃を明らかにomponents:シングル蛍光体の輝度(キャリブレーションサンプルのものと同様に、サンプルの部分漂白後に得られた分布に主に重ね合わせること、ここに示されている)と、倍程度の強度の1に相当する1。 2つの成分はそれぞれ、モノマーおよびダイマーとして割り当てることができ、二つの成分の下の領域は、単量体および二量体の相対存在量を推定するために使用することができる。一段階で単量体の粒子の漂 白(B)実施例(C特徴的な2段階の漂白と二量体粒子の)例。 (B)および(C)中の赤線は、ステップフィッティングアルゴリズムの結果である。図はCalebiro、D. らから変更されました。10 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
記載されたプロトコルは、単一分子レベルでの細胞表面受容体複合体の空間的配置、移動度及びサイズの分析を可能にする。蛍光タンパク質の使用と比較して、より明るく光安定性である小さな有機フルオロフォアで標識化は、単一の受容体粒子の可視化を拡張できるという利点を有する。非常に低い発現レベルが達成されているので(<0.45レセプター個/μm2)は 、受容体および他の膜タンパク質の特性は、生理的なものを超えない密度で分析することができる。また、アゴニスト10又は他の操作と受容体刺激の効果は、例えば、病理学的な状況を再現することを目的とし、分析することができる。また、原因SNAP / CLIPタグ11,12で標識戦略の柔軟性に、異なる蛍光体は、自分の特定のニーズに応じて使用することができます-注目すべきは、SNAPの組み合わせおよびCLIPタグは、例えば 、二色実験を行うために使用することができる、2つの相互作用タンパク質の間の共局在を観察する。最後に、このプロトコルは、異なる細胞、トランスフェクション法および標識戦略を用いて、例えば、いくつかの点で変更することができる。
重要なステップは、非常に低い発現レベルを達成するために、トランスフェクション条件( 例えば 、トランスフェクション後のプラスミドDNAと時間の量)の最適化(広範囲に洗浄カバーガラス、フェノールレッドを含まない培地と濾過した溶液を使用して)、背景と自家蛍光の最小化を含む、効率的な標識、明るく、十分に光安定性フルオロフォアの選択。細胞の自家蛍光は可視スペクトルの青/緑の部分が高く、550 nmを超える、通常はほとんど無視できる程度であるため、蛍光体の選択に関する、赤/遠赤色のものは、通常、より良い結果を与える。特に注意は、光退色を避けることに留意する必要があります適当な細胞やフォーカス調整のための検索時に蛍光団。カバーガラス上にスポットされたフルオロフォア、ならびに単量体および二量体の受容体対照を有する試料( 例えば 、CD86は、1つまたは2つのいずれかSNAPタグ付き)10は、分析を較正し、標識効率を確認するために考慮されるべきである。
このアプローチの限界は、現在、達成可能な時空間分解能に大きく依存している。これは、主に1蛍光団からだけでなく、使用するカメラの感度及び取得速度によって収集された光子の数によって決まります。 (比較のため、従来の蛍光顕微鏡の空間分解能は、約200 - 300 nm)を30nmの - 単独、検出された粒子の局在化精度の典型的な値は20である。 ( - 8nmの約2)これらの値は、依然として、一般的な膜タンパク質の実際のサイズよりも大きい。受容体は、微小の回折限界以下の距離で落下するので範囲(約200から300 nm)を単一の粒子として検出され、適切なコントロールおよび統計解析が真の受容体-受容体相互作用8月10日の番号からランダム共局在(偽陽性)を減算するために使用されるべきで達成可能な最大取り込みレート。現在のEMCCDカメラ( すなわち 、センサの一部のみが使用される)は、少なくとも作物モードで、1キロヘルツを超えることができる。しかしながら、取得速度は、カメラに到達する単一フルオロフォアによって放出される光子の数によって制限される。実際には、少なくとも10の露光時間 - 20ミリ秒が、一般的に必要とされる。このため、典型的な捕捉速度、 すなわち 、10と50Hzの間で変化する。は、1フレーム毎に20〜100ミリ秒。蛍光体の設計、光学部品および検出技術の将来の発展はさらに単一分子法の時空間解像度を上げるようにすることができます。
The authors declare that they have no competing financial interests.
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
6-well cell culture plate | Nunc | 140675 | |
DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
Penicillin - streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
Matlab software | The MathWorks, USA |
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