高速かつ正確な呼気アンモニア測定

Ammonia is an important physiologic metabolite relevant to various disease and wellness states. It is also a difficult molecule to measure in breath, which demands particular precautions be taken to obtain accurate results. Not all factors influencing ammonia are known, but progress can be difficult without accounting for these factors.

This exhaled breath ammonia method uses a fast and highly sensitive spectroscopic method known as quartz enhanced photoacoustic spectroscopy (QEPAS) that uses a quantum cascade based laser. The monitor is coupled to a sampler that measures mouth pressure and carbon dioxide. The system is temperature controlled and specifically designed to address the reactivity of this compound. The sampler provides immediate feedback to the subject and the technician on the quality of the breath effort. Together with the quick response time of the monitor, this system is capable of accurately measuring exhaled breath ammonia representative of deep lung systemic levels.

Because the system is easy to use and produces real time results, it has enabled experiments to identify factors that influence measurements. For example, mouth rinse and oral pH reproducibly and significantly affect results and therefore must be controlled. Temperature and mode of breathing are other examples. As our understanding of these factors evolves, error is reduced, and clinical studies become more meaningful. This system is very reliable and individual measurements are inexpensive.

The sampler is relatively inexpensive and quite portable, but the monitor is neither. This limits options for some clinical studies and provides rational for future innovations.

アンモニアは、タンパク質代謝の¹ユビキタス副産物である。アンモニア測定は、したがって、臨床医は、様々な疾患と健康状態^2の評価に役立つことができます。しかし、アンモニアは、非常に反応性であるので、血液または呼気を介して、正確に測定することは困難である。一般的に使用されるものの、血アッセイ精度³についての基本的な問題を含む多数の欠点を有する。しかし、血アッセイの主要な問題は、彼らが唯一のこれまで気まぐれに収集現実である。アンモニア生理学は、多くの血中グルコースおよび他の多くの代謝プロセスと同様に、流体、これまで^4を変化させるので、これは重要である。対照的に、息アッセイは容易反復測定を可能にする、完全に非侵襲的かつ迅速である。それはユニークな方法で深刻なアンメットニーズに対処することができるので、このようにして、息のアンモニア測定は魅力的です。

呼気収集しかしながら、ユニークな問題を提示する。瀉血は本質jeoを運ぶ一方、呼吸の変動、口腔粘膜による汚染：いくつかの予測できない方法（などなど 、止血時間、汗汚れ、血球溶血、実験室での測定が遅れ^、5）、呼気測定の研究者が新たな挑戦の別のグループと競合しなければならないの誤差のpardyまたは細菌、アンモニア、周囲の空気と装置湿度や温度の影響など^6。確かに、それは未知の生物を発見する実験手順を使用して人間に実験装置を接続する作業を過小評価することは賢明ではありません。これらの障害に起因する部分では、息のアンモニアは、まだその可能性を満たしていません。

ここで、我々は、高速かつ正確な結果を得るために私たちの息のアンモニア測定プロトコルを提示する。モニター、インターフェイスサンプラー、人間の影響に注意：我々のプロトコルは、3つの分野での強さを持っています。モニターは、前述の⁷のようにライス大学の同僚によって建てられました。 MEAの基礎surementは、石英強化光音響分光法（QEPAS）音響トランスデューサ圧電水晶音叉を採用している手法である。音響波が目標微量ガス種によって変調されたレーザー放射の吸収により生成されるときに光音響効果が生じる。微量気体を音響的に変調された周波数に共振する音響セルを用いて検出される。アンモニアの吸収波長は息種を妨害するからスペクトル干渉がないことを選択しました。人間の呼気測定の目的のためには、モニターの主な特徴は、広い測定範囲（十億分〜50部から、少なくとも5000 PPBにPPB）と速度（1秒の測定）が含まれています。モニターの速度は呼吸サイクル全体で時間分解能を可能にします。

モニタは、特別に設計された呼気サンプラに結合される。サンプラーは、圧力センサとカプノグラフから構成されています。これは、リアルタイムで表示され、アーカイブ口の圧力と二酸化炭素だけでなく、センサーによって決定アンモニア濃度を測定。このサンプラは、したがって、呼気が収集されるように呼吸努力の品質を評価する技術者を可能にする。これは米国胸部学会/欧州呼吸器学会（ATS / ^ERS）8のタスクフォースによって提案された呼気の一酸化窒素_（NO鉄） _を分析するための勧告を超えてすることを可能にします。すべての息サンプリングのため、使い捨てのワンウェイのインラインバルブが息サンプラーの口ポートで使用されました。

なぜならサンプラーが提供するモニターと品質管理の速度、我々は慎重に⁹人の影響を評価することができました。呼吸するように指示されると、ほとんどの被験者は、例えば、当初は過換気。このような経口のpHや口リンス、サンプラー、モニターおよび関連するすべての配管の温度、および呼吸のモードなど、他の重要な影響は、後に研究し、FO基礎である下記R実例実験。

最後に、そしておそらく最も顕著には、複数の経験豊富な基は完全に異なるセンサ及び測定手順を用いて呼気アンモニアを測定していることを強調しなければならない。これらは重要な利点と有効性を持つことができる。完全な比較は本研究^10,11,12の範囲を超えている。

楽器の1。準備

1. アンモニア光学センサープラットフォーム、レーザーダイオード·コントローラ、カスタム構築された制御電子ユニット（CEU）、ブレスサンプラー、空気ポンプ、およびラップトップに外部電源をオンにします。
2. アンモニアセンサーの両方の排気と冷却ファンが動作していることを確認してください。注：一つは、センサの背面に位置しており、第二は、簡単にアクセスでき、センサ内に発見された。
3. 音響検出モジュールとニードル弁の温度は、アンモニアセンサボックスの側に位置するデジタル表示を確認することによって38.0℃であることを確認します。センサーは、温度が安定するまでの電力を供給されてから約35分待ちます。
4. 息サンプラーのデスクトップに見られるアイコン名「ChangeT」をクリックして、55℃に入口チューブとマウスピースの温度を設定します。その後、温度を「UPDをクリックして、続いて、上または下矢印をクリックすることで変更することができます"温度を食べた。デスクトップに戻るには、「終了」をクリックしてください。温度が安定するためのシステムは、少なくとも5分を許可します。 55℃でのサンプラとチューブの温度を維持することは、アンモニアの表面損失を最小限にする。
5. アンモニアセンサーを制御ノートパソコンにソフトウェアを開きます。プログラムは、デスクトップ上の「NH ₃ブレスセンサープログラム」という名前のフォルダ内でアクセスすることができます。このフォルダの中には、ユーザーはアイコン「主LabVIEWソフトウェア」を選択する必要があります。このフォルダには、いくつかのアプリケーションが含まれていますが、ユーザは、所望のインタフェースにアクセスするには、 "Mainsequence.vi」を選択する必要があります。画面の左上隅に「ファイル名を指定して実行」を選択します。注：これは、キャリブレーション·シーケンスをロックする行を開始します。 QEPASモニターのレーザーは、自動化ラインロック手順の間に選択された最適な電流、で動作します。このプロセスには、約25分かかります。
6. サンプラー上で新しいセッションを作成するように、EACH対象セッションが接続されたフラッシュドライブに保存されている独自のファイルを持っています。注：これは、サンプラーのデスクトップ上に見られるプログラム「ブレスサンプラー」を開くことによって実行されます。適切にセッションを識別するためにスペースがあります。セッション中に生成されたすべてのデータは、この識別子の下にフラッシュドライブに保存されます。実験の日は、典型的には、ファイル名の一部として使用される。入口とマウスピースの温度が息サンプリングプログラムに入る前に調整する必要があります。
7. インレットパイプに新たな使い捨てのマウスピースを挿入します。指からのアンモニアでマウスピースの汚染を避けるため使い捨て手袋を着用してください。

2。呼気サンプル集

注：関連する治験審査委員会（倫理委員会）は、ヒト被験者を含む任意の研究を承認する必要があります。大幅に息アンモニアに影響を与えることができる多くの要因がある。これらの要因は、直接で息アンモニア測定を変更することができます全身アンモニアレベルをffectingまたは計測への肺からの呼気の代謝産物の旅に影響を与えることによって。

1. 被験者が到着時に約12時間、彼らが試験前に練習から朝を控えていることは、食品を消費していないた、絶食状態で研究室に到着したことを確認してください。
2. 全く物質がデータ収集の前に、少なくとも1時間、口の中に導入されていないことを確認してください。被験者は試験前より大きく、1時間歯を磨くことを確認してください。
3. アンモニアセンサの前方に被写体を着座。インレットパイプを保持し、彼らはアンモニアの混入を避けるために、マウスピースには触れていないことを確認するために対象を指示する。
4. サンプラーインターフェイス上で「スタート」をクリックします。対象は限りができますようにのためにマウスピースに息を吐く、またはオペレータは、試料が十分であることがあると判断されるまできた。注：これは、少なくとも10秒間持続する単一のフル呼気である。口の圧力が代理としてリアルタイムで測定される流量用。色分けされた圧力計は、対象の食材を助けるし、50ml /秒の呼気流量を表し水10cmの所望の呼気圧力を維持する。それは、Fe _NOを決定するためのプロトコルのためにATS / ERSによって採用されているので、この流量を選択した。この呼気流量は、子供と大人で達成可能である。同様に再現可能な呼気3は、10％未満だけ異なることを得られるべきである。
5. 呼気サンプルが完了すると、サンプラーインターフェイス上で「停止」をクリックしてください。

3。呼気サンプル測定

1. 呼気サンプルが分析された後、モニタを動作させる検査技師は、その呼吸プロファイルの任意のセグメントを分析する能力を有する。関心のある息の一部が第III相セグメントです。これは、二酸化炭素の濃度の「プラトー」を特徴とし、ティンバーの後期に中央に見出されるATH。
2. 二酸化炭素台地を開始し、息の圧力低下が前に右停止するサンプラーインターフェイス上で縦線をドラッグすることで、試料の第III相の部分を選択します。明確化のため、図1を参照してください。
3. サンプラータッチスクリーンインターフェース上で「ストア」をクリックして、フラッシュドライブにデータを保存します。
4. 呼気データが格納されると、ユーザは、新たな呼気サンプルを開始するために「開始」を選択することができる。

4。ブレスアンモニアに口リンスし、pHの影響を示す

1. ベースラインのアンモニアレベルを確立する3呼吸をサンプリングします。呼吸が離れてから少なくとも5分を取っていることを確認します。
2. 60秒間、30mlの水の分量で十分に口をすすぐ。
3. リンス（第2）の60秒以内に呼気サンプルを収集します。時間をかけてアンモニアの変化を観察するために次の1時間にわたって呼気サンプルを収集します。注：サムplesは毎分ほど頻繁に撮影することができますが、長い間隔は、一般的に使用されている。
4. 60秒を繰り返し4.2.1のための基本的な溶液（水中の炭酸水素ナトリウム）の30ミリリットル分量で十分に口をすすぐ。
5. 60秒を繰り返し4.2.1酸性溶液30ml分量で十分に口をすすぐ。

5。ブレスアンモニアに入口と輸送管温度の影響を示す

1. 入口温度を15分かけてサンプルを3呼吸、体温、約30℃未満に設定
2. 息サンプラーのタッチスクリーンインターフェース上でデスクトップアイコンを使用して、それぞれ55℃に入口と輸送管の温度を上げる。少なくとも5分間、システムが定常状態に達することを可能にする。
3. サンプル3呼吸、加熱された注入口に離れて5分。

被験者は、ベースライン呼気アンモニアレベルの広い範囲を生成することが期待できる。健康な人は、100〜1,000 PPBの呼気アンモニア測定で一日を始めることができる。任意の流体で口をすすぐことは、すぐに検出可能な呼気アンモニアの量を変更します。中性および酸性の液は、通常、半分以上で観察されるアンモニアの量を削減する。すすぎの効果が切れるようにこれらのレベルは、その後ベースラインに戻る。水の影響は、酸が2以上の時間を最小限に検出可能な息のアンモニアを保つことができますが、15分以内に放散しているようだ。重炭酸ナトリウムなどの塩基性リンスは、20分かけてベースラインに戻る前に、検出可能な呼気アンモニアの量を二倍または三倍になります。注目すべきことに、過酸化水素は複数の他の回のすすぎより呼気アンモニアに影響を与えていないようです。このように、口腔内細菌は息アンモニア測定に大きく寄与していることをしていないようです。

注意AとしてBOVE、アンモニアセンサに結合されたサンプラーは、技術者が呼気サンプルの品質を評価するために使用できる連続データを提供する。口の圧力と二酸化炭素が呼気サンプルの検証に使用される呼気の二つの特徴があります。口の圧力がサンプラーに肺からの空気の流れを代理として機能します。技術者は、被験者が、モニターには、目的の代謝物を含む、肺胞の空気の十分な流れを提供していることを確実にする必要があります。技術者は、水の9〜10.5センチメートルの正常な口の圧力範囲を想定する必要があります。呼気は、口腔内圧の標準偏差で現れる10月20日秒にわたって非常に安定している必要があります。品質の息の標準偏差は、水1、CM下にする必要があります。

それは呼気の過程を詳しく評価することができるように炭酸ガス測定も重要である。フェーズIの間に、呼気が開始され、吐き出されたガスの組成は、事前で構成されています支配的な解剖学的死腔空気（約21％の酸素、0.03％の二酸化炭素、78％窒素、および0.5％の水）、すなわち 、前回の呼吸周期の吸入相の間で空気が吸い込まれた。フェーズIIの間、肺胞ガスが解剖学的死腔に入り、その二酸化炭素の濃度が上昇する結果が急速に残留デッドスペースの空気と混合する。呼気中の二酸化炭素濃度は、フェーズIIIの呼気ピーク値（終末呼気濃度）の間に、よりゆっくりではあるが、上昇し続けて静脈血中の二酸化炭素濃度に対応する。第III相中の二酸化炭素濃度のこの段階的な上昇は、デッドスペースの空気の残りは、肺胞ガスの混合によるものであり、歯槽嚢の排出を遅らせることになっている。フェーズIIIの終わりに息の組成物は、約13％の酸素、5％二酸化炭素、窒素78％、および4％の水である。ティンバーのフェーズIII部分の間の二酸化炭素濃度ATHは30〜40 mmHgの範囲であり得る。第III相は、これらのCO ₂濃度が（ 図1A〜D）をプラトー場所に対応します。

図1：種々の条件のための呼吸データの位相III部分を統合呼気サンプル。 1A）の呼吸データの第III相部分を統合し、一般的な呼気サンプル。緑と赤の垂直線は、線が分析されるべきであるスパンを設定する。呼気の最初の部分は無視されます。1B）を酸性のリンスは息のアンモニアに及ぼす影響。 NH ₄ ⁺へのNH ₃の転換は劇的に検出可能なアンモニアの量を低下させる。 1Cに見られるようにサンプリングされた呼気中の肺胞アンモニアの減少が流れ、結果を減少させた。減少した流れは、nを行いますotのできるだけ多く肺胞の空気が図1d）相I、II、およびIIIを統合呼気サンプルをサンプリングすることを可能にする。解析における位相IとIIを含めることは、かなりアンモニアと二酸化炭素を低下させる。これは、全身のアンモニアの不正確な反映である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

ほとんどの被験者は最初の試行で許容息を生成することができる。しかし、一部の被験者は息の繰り返しが必要になります。また、圧力および二酸化炭素これらはまた、データ解析で考慮することができ、記録されている。

リアルタイムで微量代謝物を検出することが可能な非侵襲的手順の利点は明白である。しかし、息研究のフィールドは、この潜在能力を発揮するために苦労している。息の測定は、多くの交絡因子に対して脆弱動的なプロセスである。我々のアプローチは重要な強みを持っている：具体的には、息をサンプラーに接続されたライスQEPAS基づくアンモニアモニターの感度および速度を正確に測定するに密接息コレクション因子を評価し、特定することが可能となっています。このアプローチは非常に信頼性が高い。例えば、いくつかの予備実験の後、最近の実験のために収集し、ほぼ500個々の呼吸データ点の各々は、予想される結果と一致していた^9。

呼気アンモニアに影響を与える様々な要因がよりよく理解されるまでには、到着前に被験者に徹底的かつ均一な指示を提供することが重要である。現在、我々は一般的に被験者に依頼速い朝の収集のための真夜中の後に、前の表示に1時間よりも大きな歯を磨いて、運動、喫煙、または石油燃料で自動車を充填を避ける。データ収集（ 例えば 、高繊維Vの低い繊維）は、我々が確立していない前に、私たちは様々な食品の夜をレジメンを評価しているものの、そのダイエット納得のいくように影響を与えるベースライン·データのテストの朝。朝のコレクションには、未知の理由¹³で発生するように見える見かけ日変化の影響を最小限に抑える。

呼気アンモニア収集のための他の同様に有効であるかの優れた方法があるかもしれません。これは、前の呼気コレクションに設定された時点での標準的なすすぎはまた、全身レベルを反映している可能性があり、口腔粘膜、アンモニアの有用な測定をもたらすことができること、例えば、可能である。別の経路は、口腔内を放棄し、鼻アンモニアまたは両方^10,14を測定することであるかもしれません。この後者のアプローチは、foの必要性をなくすことができRインターフェイスサンプラー。関係なく、任意の方法を慎重に湿度、温度、pH、流量、並びに口腔咽頭生物を含む、この揮発性代謝産物に関連する技術的な種々の要因を考慮する必要がある。

当然、測定方法についての仮定および判断は、データ分析上の重要なベアリングを持っています。私たちは、圧力と二酸化炭素が品質管理の重要な側面であると考えています。しかしながら、測定された、または二酸化炭素調整されたアンモニアは、ppb以下ピコモルなどの単位で報告されるべきかどうか、例えば、一定ではない。より多くの経験と自信は、エラーの様々な技術的な情報源で得ているように、データ分析における現職複雑な考察は大きな焦点に来て、この非常に挑戦的な生物学のよりよい理解を推進します。 （ 図2：ランダムおよび非ランダムエラーA生物付帯現象またはBに対する真の生物学的変動を測定する異常な呼吸。。。口腔/鼻因子またはCとD。機器の性能。）

図2。アンモニアモニタに息インターフェイスに患者のダイアグラム。 A）試験し、されるべき患者はまた、呼気収集プロセスのほとんど予測できない部分である。患者の食事、運動、喫煙習慣データ収集に大きな影響を持つことができます。B）呼気呼気ので呼吸を標準化する方法が重要であり、人から人への変数です。肺からの空気の望ましい流れを提供するために視覚的な手がかりを提供すること。C）ブレスインタフェース装置が密接に呼気一貫性Bに関連して、均一な呼気を維持するためにうまく機能する被験体と比較する上で重要な因子である。息サンプラーINTEデータポートは、ユーザーがリアルタイムで様々な呼気サンプルのパラメータを表示することができます。D）アンモニアモニタは異なる技術で現れ得る。石英強化光音響分光法は、呼気分析のための理想的であると考えられ、多くの固有の利点を持っています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

本発明の方法に重要な制限は確認をする必要があります。サンプラーは、比較的安価でポータブルですが、現在設定され、アンモニアモニタは、、もありません。その結果、対象者は、我々が簡単に診療所に当社の機器を移動することはできませんように、私たちの専用ブレス研究スペースに来る必要があります。この要因は、被験者の呼吸が単一の長い息を吐くことを要件と一緒に、被験者は研究することができる影響（肝硬変、キーターゲット人口すなわち病気の患者は、多くの場合、PRACですtically）は除外。我々は唯一つのモニタを持っているので、さらに、我々は現実的に与えられたプロトコルで研究することができる対象の数が限られている。次に、これは、サンプルサイズおよび電力に影響を与える。

上述したように、一酸化窒素のコレクションは米国胸部学会と欧州呼吸器学会の共同の努力によって標準化されました。複数のグループが息のアンモニア測定の発展に重要な貢献をしているかの息のアンモニアのための同等の条項には、現在ありません。全般、特にアンモニア中の微量の呼吸代謝測定に関する文献は^15を進化させ続けており、確かに多くの修正や今後の改善があるでしょう。 、小さく、よりポータブルで安価なモニタが成功した多施設臨床試験のために重要である。

Dr. Risby serves as a consultant for Loccioni Humancare the manufacturer of the breath sampler.

著者らは、全米科学財団（NSF）からの財政支援は、「健康と環境のための中間赤外線テクノロジー（MIRTHE）」と題されたEEC-0540832を付与認める