農業で使用する生分解性プラスチックマルチフィルムを分解するための可能性を持つネイティブ土壌微生物の分離

"生分解性"というラベルの付いたプラスチックフィルムはmulchesとして農業用市販されている。耕作は、魅力的な処分方法を表しますが、フィールド条件下での劣化はあまり理解されています。本研究の目的は、フィールド埋葬後にプラスチックマルチフィルムを植民ネイティブ土壌菌類や細菌を単離する方法を開発することであった。

市販の生分解性マルチ（BDM）フィルムを植民地化し、農業の土壌に自生する菌類を分離し、プラスチックを分解する可能性について評価した。典型的には、プラスチックの製剤は公知であり、原料の供給源が利用可能である場合には、粉末状のプラスチックがクリアゾーンの視覚化によって決定される寒天ベースのメ​​ディアおよび分解中に懸濁させることができる。しかし、このアプローチでは不十分BDMS の in situ分解に模倣している。まず、BDMS、土壌マトリックス全体に小さな粒子として分散されていない。次に、BDMSは、純粋なポリマーとしてではなく、微生物の増殖に影響を及ぼす可能性の添加剤（ 例えば充填剤、可塑剤および染料）を含有する膜として市販されていない。本明細書に記載した手順を土壌埋め込み型マルチフィルムから得られた単離に用いた。発掘BDMSから取得真菌分離株はない炭素源eを含まない規定培地の上に置いた新しい、消毒BDMSの部分に成長のために個別にテストされました寒天をxcept。 BDMS上に成長した単離物がさらにBDMSが追加された唯一の炭素源であっ液体培地において試験した。約10週間後、菌のコロニー形成とBDM劣化を走査型電子顕微鏡により評価した。分離株はリボソームRNA遺伝子配列の分析によって同定した。このレポートは、真菌単離するための方法が記載されているが、細菌は、細菌のための適切な媒体を置換することにより、これらの方法を用いて単離した。我々の方法論は、プラスチック原料が使用可能どちらか不明ではありませんそのため無傷プラスチックフィルムまたは製品の内訳を調査研究のために有用であることが分かるはずです。しかし我々のアプローチは、BDM劣化の速度を比較するための定量的な方法を提供していません。

内訳は、製品の寿命及び耐久性を短縮するため、劣化が歴史的に、プラスチックポリマーの望ましくない属性と考えられてきた。最近では、自然環境^1,2,3で廃プラスチックによって提示された環境問題への意識は、生分解性プラスチックを従来のプラスチック材料に魅力的な代替手段を行っている。分解は、（構造的変化、断片化、および分子量の低下、整合性、および強度^4,5として定義される）の両方の非生物的プロセス（熱応力、光酸化、加水分解、浸食、機械的ストレス）を含む一連の出来事、を介して行われると生物学的分解^6。非生物的プロセスは断片サイズやプラスチックの特性を変えることができるが、微生物は水と二酸化炭素（好気条件での）および/またはメタン（嫌気条件下）への最終的な鉱化に必要とされる。

のための実質的なニッチ生分解性プラスチックは、プラスチックmulchesが土壌水分を保持するために、土壌温度^7,8を高めるために、雑草の成長を防止するために使用される農業に存在する。米国だけで数千エーカーの何百もの生分解性プラスチックで構成mulches含むプラスチックmulches ^9、で覆われている。作物の生育期に続いて、生分解性mulches（BDMS）を処分するためのオプションは、埋立処分、エネルギー回収¹⁰焼却、堆肥化を経由して劣化、または耕作¹¹後の土壌中での劣化があります。これらのうち、少なくとも労働集約的な運命が土壌にBDMSを耕しているが、春の耕作と作付け時に効率的な劣化や石灰化することなく、非作物ヶ月（一般的には冬に）中に、プラスチックの断片が残っている可能性があり、農業機器に干渉し、彼らはかなり野生動物、植物、そして微生物^1,2,3,10に影響^を及ぼす環境中に残留。

農業用マルチフィルムを含む多くのプラスチック製品は、ラベルの練習で、 "生分解性"や "堆肥"、劣化や石灰を受けるには、土壌の分解のためにあまりにも非効率的な、および/またはあまりに不完全かもしれない負担が、これらの製品の廃棄のための実行可能な代案。例えば、オキソ生分解性ポリエチレンは、堆肥の温度は25℃で¹²だったときに℃の堆肥、及び鉱化作用の半分以下の量が発生した58に風化の1年3その後の数ヶ月後にのみ12.4％の石灰化を達成しました。冬には、ほとんどの場所で土壌温度は少ない鉱、おそらくさらに低い微生物の活性が生じ、その結果、これらの温度のいずれよりも低くなる。分解速度を遅くすることに加えて、 "生分解性"という用語の誤用は、農業を含め消費者が^13,14によってこれらの製品への不信感につながっている。生分解が変換である二酸化炭素（及び/又はメタン）と微生物⁴天然由来による水¹⁴へのポリマー。そのため、生分解を化学測定されなければならない;基板と微生物の物理的会合は、その材料の微生物分解を意味するものではありません。

農業におけるBDMSの持続可能な利用を検討するための努力の一環として、本研究では、植民地化と市販BDMSを低下農業の土壌に自生する微生物の発見に焦点を当てた。標準的な試験方法は、化学的に非生物的および生物学的手段^15,16,17による生分解性プラスチックの分解を測定するために公開されている。しかし、これらの方法は、個々の微生物の種によるプラスチックの劣化に対処する、またはそれらの単離のための方法を提供しない。方法論は、ここより密接に真菌の胞子を持つ検体を接種した後、微生物の分解への抵抗のためにプラスチックを評価するために設計された標準的な方法に似ている18,19。

プラスチックの製剤は公知であり、原料のソースが利用される場合、粉末状プラスチックをクリアゾーン¹³の可視化により決定寒天ベースのメディアおよび分解中に懸濁させることができる。この方法は、ポリウレタン^20、ポリ（ブチレンサクシネートアジペート- コ - ^）21、及びポリ（乳酸^）22のようなポリマーを分解する微生物を同定するために以前に使用されている。同様の方法は、プラスチックが唯一の炭素源^20,23である液体媒体中に純粋なプラスチック粉末を懸濁さ含む。これらの方法は定義されたシステムの利点を有するが、それらは不十分BDMS の in situ分解に模倣する。 BDMS、土壌マトリックス全体に小さな粒子に分散させ、むしろ、フィルムとして販売され、使用されないため、まず、表面積が異なって分配される。第二に、BDMSの化学的構成は純粋なポリマーとは異なります。 BDMSは一般的にそのような添加剤を含んでい充填剤、可塑剤、及び着色剤、及びこれらの添加剤は、それにより微生物の増殖や、石灰化の速度に影響を及ぼすことがある。本研究では一定の商業膜の組成は、そのフィールドレディ形で独自、プラスチックフィルムであったため、この理由のため、および真菌や細菌を単離するために用いた。簡単にするために、以下の方法がどこに細菌の単離のための適切な修正が指摘して、真菌に対してのみ記述されている。

土壌内の1つの冬のために最近の研究²⁴では、3市販BDMS一実験映画は、一生育期のために、米国の三つの異なる地域での農業のサイトで使用され、その後メッシュ（250ミクロン）の袋に入れて、埋められた同サイトで。 250ミクロンメッシュ開口部は根とほとんどの土壌動物相を除き、土壌侵食^25,26を最小限に抑えながら、菌糸が浸透することができます。ナイロン材料は、土壌中の袋の劣化を防止する。掘削、Fに続いてungal分離株はBDM片から回収し、寒天とプレ消毒された新しい、未使用のBDMフィルム5cmの×5センチ、表面消毒広場を除く炭素源なしで最少培地上での増殖のために評価した。フィルムとして使用されるほとんどのプラスチックは、整合性を損なうことなくオートクレーブすることができませんので、UV光は、プラスチック上に存在する任意の微生物細胞を殺すために使用されていました。 ISO 846 ^{19は、70％}エタノールとその後の乾燥で表面disinfestingお勧めしますが、この方法を使用する場合は、1は、フィルムのない成分又は添加物に悪影響をエタノールの影響を受けていないことを確認する必要があります。 BDMSはおそらく日光に耐えるように製造されるので、UVは、除染方法として選択した。

一人で最少培地上でより良いBDM作品に育った株は、さらなる研究のために選択した。それは、典型的には農園医学的にないことにより、代謝的に利用されないため、寒天、海藻によって生成された多糖は、微生物のメディアを固化するために使用されるできる微生物はいますが、寒天加水分解酵素は、土壌²⁸から単離された海洋細菌²⁷と寒天分解細菌から単離されている。 BDMポリマーおよび寒天は、潜在的な栄養源として、これらのポリマーが含まれている環境で進化していない土壌菌によって分泌酵素の珍しい基質であることが期待が、両方の基質は（ ステップ7）明細書に記載のプレートバイオアッセイに存在している両方。炭素源としてBDMSではなく、寒天を使用する真菌BDM膜（実験））寒天培地（陰性対照）、 二除いi）を添加しない炭素源を含む寒天固化媒体上に成長を比較することによってのみ、寒天を使用する真菌から区別することができる及びiii）グルコース（陽性対照）。すべての分離株の成長が最少培地に加えてグルコースに期待されている菌類に起因しないグルコース含有プレートは、実​​験に使用される特定の最少培地上で成長することができないかもしれません。ポテンショアルBDM degradersは寒天固化最少培地+、彼らは一人で寒天固化最小培地で生育よりも良いBDMフィルム上に成長する必要があります。最小培地プレート上で生育菌類は寒天degradersまたはoligotrophsであり、またバイオアッセイプレートではなく、フィルム自身（彼らは偶然にもBDMポリマーを分解する場合を除きます）にBDMフィルムに関連付け寒天上に成長すると予想されます。

BDMSの寒天としないの利用に起因する微生物の成長を見ての可能性を排除するために、我々は、定義されたブロス培地（ ステップ9）バイオアッセイと寒天プレート上BDM植民地化のために我々の最初のアッセイを追った。 BDM片バイオアッセイチューブにのみ知られている炭素源を表した。

最初のスクリーニングの後、および分離株のグリセロールストックを復活時には、いくつかの既知の炭素源を含まない液体培地中で定義されて乏しいが、目に見える菌糸を形成した。これらの結果は、取得された単離物のいくつかはoligotであることが示唆されたrophs -炭素、窒素、水環境や大気^29,30,31における揮発として存在するのいずれかで溶解し、他の栄養素の非常に少量を捕捉することによって成長する生物。 18SリボソームDNA分析を通じて種の同定には、以前に栄養不良^32を示すこと^が報告された真菌属にマッチした分離株の多くは、このビューをサポートしていました。一般的に腐生ですOligotrophsは、環境³⁰の範囲内の基質利用のための代謝機能の広い範囲を必要とする。したがって、BDMS（おそらく珍しい酵素の機能を必要とする）から、我々は孤立した同菌は貧栄養の能力を実証し、そのような空気中の指紋、ほこり、または微量揮発から皮脂などの微量汚染物質で成長することができたことは驚くべきことではない。 oligotrophsの分離のために、我々は一人でBDM表面にその成長がBDMの内訳を推測するために使用することができなかったと結論付けた。本明細書に記載の方法は、SCへの取り組みを反映している説明善意の BDMの故障のための農業の土壌からREENネイティブBDMの植民。

この手順では、土壌中のBDMフィルムのインキュベーションに少なくとも数ヶ月を必要とし、寒天プレート上と植民地化や劣化を評価するための寒天フリー、化学的に定義された培養液の両方のシーケンシャルバイオアッセイのためのいくつかのより多くヶ月。個々のメソッドは、それらが実行される順序で一覧表示されます。

1。土壌中BDMフィルムのインキュベーション

彼らが低下することが予想される際のものを模倣した条件下での土壌にBDMフィルムを組み込む。常駐土壌やサンドイッチ13×13センチメートルナイロンメッシュ（250ミクロン）の袋の中の土壌は10センチメートル×10センチBDM 400グラム（乾燥重量換算）を取得。ナイロン糸で閉じます。インキュベーション時間は、実験者の裁量である。モニタおよび/ ​​または適切なインキュベーション期間を通して定期的に微生物活性（ 例えば土壌温度、栄養素と水分）に関連するパラメータを変更します。

2。メディアの準備および試薬

メディアと文化管にうっかり栄養源を導入するのを避けるために、試薬グレードの化学薬品、新しく購入した培養管を使用し、混合メディア用I純（ 例えばナノ純）水、及び厳重洗浄したガラス製品を入力します。試薬の交差汚染を避ける - この目的のために試薬やガラス製品の専用セットを使用するのが最善です。それは真菌の増殖が下記の試薬中の成分によって阻害される単離され得ることが可能であることに留意されたい。その場合は、いくつかの最適化が必要とされ得る。

1. 事前のメディアを作ることに、その後実験室用洗剤と酸洗浄（ 例えば 、10％のHCl中で一晩浸漬）で必要なすべてのガラス器具を洗う。蒸留水で12倍の最​​小値をすすぎ、二回超純水である。ほこりを除外するクリーンアルミホイルですべてのガラス製品をカバーしています。手袋を着用し、指紋から皮脂を除外するために血管の内側と縁を触れないでください。どんな石鹸住民を回避するために、会費と植民地化を容易にガラスで傷、新しく購入した中の培養菌（未使用）、すすぎ、オートクレーブガラス培養管とキャップ。
2. ポテトデキストロース寒天 （PDA）は、土壌から菌類の初期分離するための、単一の単離されたコロニー長期保存用接種の発生を確立するために使用される。製造元の指示に従ってメディアを準備し（50℃に冷却する）オートクレーブ処理した後、細菌を排除するために、30μgの/ mlの最終濃度にクロラムフェニコール（EtOH中10 mg / mlのストック溶液から）を追加します。この培地は、現在PDA CHL ³⁰と呼ばれています。
3. 真菌の最少培地 （FMM）は、潜在的な真菌プラスチックdegradersを接種BDMSための強固な基盤として使用されます。別に寒天（媒体を固化するために使用される場合）から、カーボンフリーである。脱イオンH ₂ Oの約800 mlに、6.0グラムのNaNO _3、0.52グラムのKCl、0.52グラム_硫酸マグネシウム_を追加·7H2 O、1.52グラムKH ₂ PO _4、1mlのHutnerの微量元素のストック溶液（2.2グラムのZnSO _{4·7H 2} O、1.1グラムH ₃ BO _3、0.5グラムのMnCl _{2·4H 2} O、0.5グラムのFeSO _{4·7H 2} O、0.16グラムのCoCl _{2·5H 2} O、0.16グラムのCuSO _{4·5H 2} O、0.11グラム（NH _{4）6MO 7} O _{24·4H 2} O、100mlの蒸留H ₂が5.0のNa ₄ O ³³ EDTA ^、34。NaOHを用いてpHを6.5に調整し、液体バイオアッセイ用体積1リットルをもたらす、塩の沈殿を避けるために、FMM濾過滅菌し、固体媒体が望まれる場合は16グラム寒天、オートクレーブを加える。半固体寒天である場合50に冷却する際に必要な、8グラム/ Lに寒天を減らす°C、30μgの/ mlの最終濃度にクロラムフェニコールに追加します。この培地は現在FMM CHL ³⁰と呼ばれています。コントロールとして、真菌分離株で育つことを確認するこの培地、FMMは、MAでなければなりませんデ上記しかしリットル当たり10グラムグルコースを含む。これはグルコース最小培地^35（GMM）と呼ばれています。
4. リン酸緩衝生理食塩水 ^36（PBS）は土壌暴露BDMSの初期段階希釈で土壌粒子や微生物細胞を中断するために使用されます。 PBSを作るために、蒸留水800 mlに8gのNaCl、0.2gのKCl、1.44g _の Na ₂ HPO _4、および0.24グラムKH ₂ PO _4を加える。塩を溶解し、HClでpHを7.4に調整してください。超純水で1 Lに総量を持参してください。 9.5ミリリットルとチューブあたり4.5ミリリットルのPBSでクリーンな培養管を埋める。オートクレーブ。
5. 30％（v / v）のグリセロールを -80℃で保存中に凍結保存した細菌、酵母細胞、芽胞、および真菌の菌糸体を中断するために使用される超純水でこのソリューションを作る。オートクレーブ。
6. 0.01％（体積/体積）のトリトンX-100は、真菌胞子を停止するために使用され、清浄剤は、疎水性胞子のための非毒性の湿潤剤として作用する。 100μlのトリトンXを解散超純水1Lで-100。オートクレーブ。
7. 0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）中にSEM固定グルタルアルデヒドのための溶媒として使用される。 1 MのNaH ₂ PO ₄の1MのNa ₂ HPO _4、31.6ミリリットルの68.4ミリリットルを混合し、超純水³⁶で1 Lに総量をもたらす。

3。バイオアッセイの材料の調製：BDM薄膜の表面除染

1. 切削器具の上に紙やテープのような汚染物質の残党は、潜在的な炭素源であるので、新たに購入したハサミや新鮮なかみそりの刃、および切断するための無機表面を使用しています。皮脂とBDMフィルムの汚染を避けるために手袋を着用してください。小さな正方形（4.25×4.25 cm）のにBDMフィルムをカットします。このサイズの正方形は標準100×15ミリメートルペトリ皿に収まります。
2. BDMフィルムを除染するために殺菌UVランプ（発光波長は= 253.7 nm）を使用します。このようなランプは、多くの場合、標準的なバイオセーフティキャビネット内で発見された。ていることを確認したときUVライトが動作している、BDMフィルムを汚染可能性がバイオセーフティキャビネットに外気の全く流れがありません。
3. 70％EtOHでフードの内側湿った表面や空気をフラッシュする15分間送風実行してみましょう。その後、サッシを閉じて、2時間のためにUVをボンネット表面を除染。
4. 行で、除染フード内BDMフィルムを置きます。 UV光は2時間のフィルムを照らすことができます。
5. BDMフィルムを反転する、クリーン、滅菌ピンセットを使用してください。最前列でスタートし、手や腕に直接新しく染BDM表面上にある時間を最小限にするために後列に働く。 BDMSを反転すると、フィルムの非消毒側ではなく、以前に接触して紫外線にさらされるクリーンな領域に下向き新しく消毒側に配置します。
6. それぞれの側にUV処理の2時間後に、滅菌ピンセットでバイオセーフティキャビネットからBDM膜を除去、再び既に除染の上に手や腕を配置しないようにするために、前面から背面に取り組んでNATをフィルム。このような箔で覆われたビーカーなどの無菌、乾燥した、覆われた容器にBDMフィルムを置きます。暗闇の中で、室温で保管してください。

4。プレートバイオアッセイのセットアップ

無菌技術を使用して無菌転送フードのすべての手順を実行します。

1. 寒天プレートの表面に紫外線消毒BDMピースを置きます。最初に一つの角を下に設定し、優しく寒天と接触させる四角いロールの残りの部分を聞かせて。しわを避ける。いくつかのフィルムは、貯蔵中などにしわを形成し、これは避けられない。特に薄膜片は平らにするために、2つの鉗子を使用する必要があります。
2. 水と疎水性のプラスチックの初期の植民地化のための栄養源を提供するために、プラスチックフィルム上に半固形FMM CHL ³⁰寒天の代わりにビーズ。ビーズは、透水性のフィルムのために必要ではありません。電子レンジで寒天を再溶融し、（各CORに1腐葉土に溶融寒天の410μlの滴を転送するためにピペットを使用NER）。それは穿刺可能性がある腐葉土に直接ピペットの先端には手を触れないでください。プレートを反転させたときに腐葉土に余分な体重は、寒天表面からプラスチックを引っ張ることができるので、ドロップあたり10μLを超えないようにしてください。
3. プレートが完全に固化するために一晩で蓋と右側座った後、暗闇の中で4℃で密閉された袖寒天側を上に保管しましょう​​。ときはバイオアッセイ（ ステップ7）を実行する準備ができて、）1 FMM CHL ^30（ネガティブコントロール）のプレート、ⅱ）の半固体FMMプラスチックフィルム上にCHL ^30、およびIIIの410μlの滴を含むものバイオアッセイプレート）1プレートIを使用GMM（陽性対照）。このように、4人はそれぞれの複製媒体のプレートにつきテストすることができる分離。

5。液体バイオアッセイのセットアップ

1. BDMは、 ステップ3.1に切断するための指示に従ってください。液体バイオアッセイのためにプラスチックフィルムを切断する前に、培養管に適合するサイズを選択します。いくつかのプラスチックのタイプの間で均一な質量を達成するために必要な領域は、膜厚に依存する。私たちは、0.0175グラムに相当する部分が15×150ミリメートル培養管によく合うことがわかった。
2. 上記の手順3で説明したように、UV光でフィルムを表面除染。
3. 微生物の分離の各反復では、接種のための3つのチューブを準備します。i）BDM所定の大きさの断片（実験）、ⅱ）無炭素源（ネガティブコントロール）を備えた5ミリリットルFMM、及びiiiを含む5ミリリットルFMM）を5ミリリットルをGMM（陽性対照）。さらに、テストする各BDMを含むFMMのチューブを複製する準備が、それらを接種していない。これらの制御管は汚染に起因する任意の微生物の増殖を明らかにする。

6。菌類の分離

以下の土壌インキュベーションおよびサンプルの除去、菌類はBDM膜に付着する土壌から単離される。必要に応じて、細菌がsimultaneouできますSLYは、真菌の増殖^を阻止^{する37〜50μg}の/ mlのシクロヘキシミドを補っ1/10X希薄トリプシン大豆酵母寒天などの土壌細菌の単離のための適切なメディアを使用して、同じ方法で分離する。定義された培地はステップ5と7で細菌の単離のために必要な場合には、M9 ^38（プラスシクロヘキシミド）は良い選択です。

1. サンプルの処理に先立って、PBSやPDA CHL ^30を準備します。 PDA CHL ³⁰プレートは蓋と寒天表面の結露を除去するために約24時間室温で（unbagged）乾燥させます。プリラベルPDA CHL ³⁰プレート。
2. ステップ1で選択された埋葬サイトからBDM片を含むメッシュバッグを掘削。 4で船と店舗℃の土壌から抽出した後48時間を超えない。
3. 滅菌ヘラとピンセットを使って、優しくプラスチックが露出するまで土を削除するが、BDM膜表面に付着している土をはねのけるません。 1センチメートルにBDMフィルムをカット材料0.5gを2個までの合計は、4つの反復毎に回収される。 PBS 9.5 mlを入れた25ml培養管に0.5グラムBDM膜及び添付土壌を転送します。腐葉土が完全に分解されるか、土壌のみ制御が処理されている場合は、PBSに土壌の0.5グラムを加え、可能であれば、まだ残留腐葉土から変色している​​部分を選択します。
4. 9.5ミリリットルPBS高速で30秒、0.5グラムを含有するマルチ渦培養管は、30秒で再び10分間、ボルテックスための超音波処理超音波処理水浴中。攪拌がバイオフィルムを分解することを意図している、物理的に埋め込まれているか、またはマルチピースに付着して細胞を除去し、均質な懸濁液を作成します。
5. シリアルめっきから個々のコロニー形成単位を得るために、PBS /土壌ソリューションを希釈するために準備します。各サンプルについては4.5 mlの滅菌PBSを充填した層流フードの文化チューブ内の場所。各サンプルについて、450μlのPBSでいっぱいディープウェル、96ウェルプレートの3井戸を埋める。
6. オリジナルのプラスチック/土壌懸濁液（0.5グラムの腐葉土を加えたPBSの溶液9.5ミリリットル）がプラスチックに付着微生物材料の5.0×10 ^-2希釈を表しています。 5.0×10 ^-3希釈を得るために、培養管では、このオリジナルのチューブから滅菌PBS 4.5 mlに懸濁液を0.5ミリリットルを追加します。高速で30秒間ボルテックスする。 96ウェルプレートにPBSを450μlに50μLを加える。すべてのサンプルについて繰り返し/複製されます。 一斉にサンプルを希釈するためにマルチチャンネルピ ​​ペッターを使用してください。上下に10回ピペッティングして、それぞれの新しい希釈を混ぜる。希釈の間にヒントを変更します。 5.0×10 ^-6に希釈液を作る。
7. （オプション）細菌の単離は、本明細書に記載の試料中の真菌分離株よりも豊富であった。同時に細菌を分離するので、あれば、上記の手順6.6で5×10 ^-8に段階希釈を行う。
8. 均等に5.0×10 ^-3からそれぞれ5.0×10 ^-6を通じて100μLを広げる火炎滅菌曲がったガラスロッドとPDA CHL ³⁰プレートの寒天表面を横切って希釈。ストアプレートは直立30分間その後未確認分離株から胞子のエスケープを避けるために、パラフィルムでプレートを密封し、液体に浸漬させます。 ℃の暗闇の中で両方の迅速かつ成長の遅い菌類がコロニーを形成することを可能にする5日間20℃反転プレートをインキュベートする。

7。プラスチック分解菌の最初の選択

重要：この時点からのすべての培養物は未知のアイデンティティの胞子による環境の汚染を避けるために、唯一のバイオセーフティキャビネット（しない層流フード）で開くことがあります。いくつかの土壌菌類やバクテリアは、潜在的なヒト病原体である。

1. よく分離したコロニーを含む希釈プレートを調べます。別のコロニーに触れていないコロニーを選択します。
2. シングル滅菌爪楊枝を使用して、優しくFMMの寒天を（ ステップ2.3で行われた植民地をタッチし、をタッチ）、FMM +プラスチック（ ステップ4で行われた）、およびGMM（ ステップ2.3で行われた）のプレート、。プラスチックフィルム上に寒天ビーズを接種するために、寒天ドットの表面に優しくつまようじをこすった後、プラスチックフィルム全体でスワイプ。各プレート上の4つの反復筋がなくなるまで同じソースコロニーから接種を繰り返します。
3. いくつかは、すべて視覚的に固有のコロニー型の複製毎BDMサンプルから選択されるまで繰り返し7.2を通じて7.1手順 。
4. 反転、パラフィルムでプレートを密封し、5日間暗所で20℃でインキュベート。
5. 彼らはFMMで育つよりも良いBDMSに成長分離を識別します。成長が明らかでない場合には、植民地化、またはその欠如（ 図1）を確認するために解剖顕微鏡下で標本を見る。上の蓋を保持し、蓋が結露している場合、新しい蓋と交換しますが、バイオセーフティキャビネット内で行ってください。
6. 一度潜在BDMのdegradersが選択されている、として使用プラスチック自体、およびPDA CHL ³⁰プレート上で単一のコロニー形成単位の単離のための筋に定着菌から種菌をこすりするterile爪楊枝。
7. パラフィルムとインキュベートPDA CHL ³⁰プレートをシールプレートは、暗闇の中で5日間20℃でプラスチック分解分離株を接種した。
8. 単一の分離したコロニーを精製していることを今、彼らはテストされているプラ​​スチックフィルムを植民地化することが本当にできることを確認。滅菌した爪楊枝を持つ単一のコロニー形成ユニットから接種を（胞子、酵母細胞、または菌糸）を収集。繰り返し7.5を通じて7.2手順 。 20℃でのインキュベーションの5日後に、真菌の成長のためのバイオアッセイプレートを調べます。分離は、それが両方の最初の（7.5）と第2（7.8）試験でFMMで育つよりも良いBDMフィルム上に成長した場合、その後、 ステップ8に説明分離保管してください。

8。プラスチックDegradersの長期保存

全体的に、プラスチック分解単離物（7.8）を再びプレートバイオアッセイで試験し、そして最終的に、液体バイオアッセイで試験した（単一の単離されたコロニー形成単位（7.6）に再精製し、（7.5）プレートバイオアッセイにおいて試験される9.1から9.5）。テスト中、分離株は毎月新鮮な培地に転送する必要があり、作業株式板は°Cとすぐに十分な成長が表示されているように4で保存した。分離株はまた°C、および/または滅菌フィルターディスク上に乾燥した胞子のように4℃-80℃でグリセロールストックとして保存する必要があります両方の格納方法を以下に説明する。

1. それぞれが、それは両方の最初の（7.5）と（7.8）第2プレートバイオアッセイでFMMに育ったよりも良いBDM膜の上に育ったことを分離のために、2つまたは3つの滅菌ろ紙ディスクに直径約1cmの2 PDA CHL ³⁰プレートを準備、表面上。から、これら二つのプレートに接種上記のステップ7.8で選択した同じ単一コロニー。成長を最大化するために、寒天に均一に接種を広めることで芝生を作る。 5日間20℃でパラフィルムとインキュベートでプレートをシール。このステップは、効率のために、ステップ7.8と同時に開始することができます。
2. 寒天表面上にフィルターディスクは菌糸/胞子で覆われるべきである。滅菌ピンセットで寒天表面からフィルタディスクを取り外し、滅菌エッペンドルフチュー​​ブに入れます。空気は、交差汚染を回避するために、バイオセーフティキャビネットまたは最小限の空気の動きと他の乾燥、無菌環境でエッペンドルフチュー​​ブ（キャップ​​をオフにして）内側一夜フィルターディスクを乾燥させてください。その後、4℃でパラフィルム、およびストアで密封
3. 芝生プレートから胞子や菌糸を収穫するために滅菌綿棒や爪楊枝を使用してください。 -80℃で30％の液体窒素でクリオバイアル、フラッシュ凍結中のグリセロール、及び店舗で胞子や菌糸サスペンド℃に

9。厳しい共同液体バイオアッセイ経由プラスチック利用のnfirmation

1. 潜在的なプラスチックの劣化分離株から胞子を接種PDA CHL ³⁰プレート：新鮮な胞子および/ ​​または液体培養に接種すると、細胞を生成します。パラフィルムでプレートを密封し、真菌の胞子が見えるようになるまで20℃でインキュベートする。
2. バイオセーフティキャビネット内でプレートを洗浄することにより、収穫胞子0.01％トリトンX-100（15×100mmのペトリ皿うまく当たり5ml）および滅菌曲げガラス棒で表面から胞子（または酵母細胞）をスクラブ。滅菌容器に胞子（またはセル）サスペンションと転送を吸引。
3. 血球計で胞子または細胞をカウントし、1×10 ⁶胞子/チューブの合計FMMブロス5ミリリットルに追加するには、適切な音量を決定します。ボリュームが10μL未満でなければなりません。 0.01％に濃縮された胞子懸濁液のトリトンX-100の希釈が必要な場合があります。
4. 無菌転送フード内で調製培養管に接種6胞子（または酵母細胞）と>ステップ5。特に未確認の分離のために、胞子のエスケープを避けるために、パラフィルムでキャップをシールします。 20°Cで、暗闇の中でインキュベートし、成長のために毎週のサンプルを観察します。
5. プラスチックフィルム上の菌の菌糸成長が特にプラスチックフィルムの縁で、接種後の最初の週間以内に目に見えるかもしれません。浮遊性酵母（曇りメディアから明らかなように）については、成長が600nmでの光学密度の測定値によってモニターすることができる。真菌は、プラスチックフィルムに直接接続する可能性があるので、成長は眼によって評価され、光学顕微鏡および/または走査型電子顕微鏡（SEM）により確認することができる。
6. FMM-コントロールだけでは、分光光度法を用いて光学濃度の変化を登録するには小さすぎる極小白点を探してください。これらの細片は、パスツールピペットで吸引し、微分干渉（DIC）顕微鏡を用いて観察することができる。斑点は、多くの場合、識別不能PRECIですpitate、いくつかのケースで、彼らは発芽したが、実質的に成長していなかったオリジナルの接種​​の塊かもしれません。
7. 実験試料およびコントロールの植民地化を比較するために、視覚と顕微鏡観察を使用し、BDMフィルムの各サンプルの成長に格付けを割り当てる。多くBDMSカラーで暗いとエッジ以外では顕微鏡を経由して、最小限の観察を可能とし、膜厚は油浸レンズで観察することを禁止するので、SEMは）に記載の評価システムを介して、 例えば微生物増殖の存在は 、 私を推定するのに便利です表1、 およびii）BDM劣化の程度。

10。 SEMサンプルの調製

1. 複製サンプルからBDMの小片をカットするクリーンで、無菌のハサミを使用してください。 24〜48時間、0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液中の2.5％グルタルアルデヒド（pH7.2）中に浸漬することによりBDMSを修正する。
2. 固定が行われている間、5〜10％VOを添加することによって、純粋な100％エタノールを脱水LUME 3Åの分子篩（175から260℃の乾燥オーブン中で活性化し、デシケーター中で冷却）、及び総脱水を確実にするために、室温で一晩座ることができる。
3. 各15分の4回の洗浄のために0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）に浸しBDMS。
4. 5分ずつ3回洗浄用超純水に浸しBDMS。
5. 各濃度で20分間浸漬し、エタノールシリーズでBDMサンプルを脱水：50％、70％、80％、90％、95％、および100％。すすぎあたり20分間、100％エタノールで2回BDMSをすすぐ。
6. 臨界点乾燥へと対象サンプルはスパッタコーティング。

最近の研究²⁴では、4人は、 "生分解性"というラベルの付いた3市販BDMSそれぞれ、プラスの実験映画と従来のプラスチック制御、マウントバーノン、ワシントン州では、2010年の春にトマトの生産のための腐葉土として土の上に配置されたを複製ノックスヴィル、テネシー州、そしてラボック、テキサス州。 2010年秋には、BDMフィルム正方形は4反復のプロットで腐葉土を風化それぞれから切り取った、そしてネイティブ土壌マルチサンプルが切除されていたエリア直下から削除されました。それぞれがステップ1で説明したようにBDM正方形ナイロンメッシュバッグの内側に土の中に挟まれた風化。土壌専用コントロールも含まれていた。バッグは、同じプロットと以前に腐葉土に覆われた行の土壌の7.5センチメートル下に埋もれて、7ヵ月後の2011年春耕作、までの場所に残っていた。バッグはその後、シャベルとプロットから持ち上げジップロックのビニール袋に入れ、翌日配達のためにアイスパックで研究所に出荷されました。

本明細書中に記載さプレートバイオアッセイを使用して、BioAgriからWeedGuard Plusと3から3つの潜在的なBDM分解分離株を回収した。三重で-これらの分離株は、液体バイオアッセイ（9.7上記のステップ9.1）に供した。いくつかの真菌の増殖は、液体バイオアッセイの1週間後BDMSの端に沿って見られたものの、サンプルが収穫し、最終観察前に68日間インキュベートした。 SEMを使用して、菌糸は、我々は、棒状細胞（ 表2）観察XX YYと、を除くすべての試料について観察された。 XXとYYはPDA CHL ³⁰酵母形で成長するので、この観測が期待されていた。

WeedGuard Plusの分離については、全く成長がFMM専用コントロールでは観察されなかった。最もBDM劣化はSSを分離することによって植民地化試料で観察された。未接種のcontroでWeedGuardプラス腐葉土（ 図2A）のためのlsが、植物由来繊維の残留導管の要素が若干あばたマーキング繊維のいくつかの上の行で見られるようにのみ検出可能である。菌糸は、すべての3つの接種試料で観察されたものの、導管の要素は、セルロース系材料の消化は下木質化導管の要素を明らかにしたことを示唆している、唯一のSSサンプル（ 図2B）ではっきりと見えていた。隔離するSSは暫定的に18Sの注文Sordariales内sordariomyceteとしてリボソームDNAを用いて同定された。

BioAgri分離株については、有意な成長はFMM専用コントロールでは観察されなかった。分離VVとZZの培養管はDIC顕微鏡を用いて観察した時に目に見える渦巻くシングル白斑点。 VVを分離するため、斑点は初回接種からおそらく残留胞子塊（図示せず）、であった。 ZZを分離するため、質量は約0.2ミリメートルの直径菌糸の緩いメッシュで構成されていた、オリジナルの胞子接種が発芽していたが、 図3Aに描か質量を超えて成長していなかったことを示唆している。

BioAgriのマルチ（ 図3B）が未接種対照において、でこぼこのテクスチャが観察される。白の特徴の身元は不明であるが、彼 ​​らはVV（ 図3C）を分離することによって植民地映画の中で存在しない。白色粒子とバンプ両方がZZ（ 図3D）を分離することによって植民地化され、フィルムになくなっている。また、後者の試料は、BDM表面を横切る一様な亀裂の発生が認められた。 VVとZZは、暫定的に18Sのペニシリウム属としてリボソームDNAを用いて同定した隔離。 （VV）と注文ボタンタケ内sordariomycete（ZZ）、それぞれ。

表1プラスチックフィルムのテストサンプルで評価微生物の成長のためのスコアリングシステム。

表2から得られた真菌の単離のための観察と成長評価後で未風化BDM材上に接種し、20℃で68日間培養し、マウントバーノンで（7ヶ月）2011年春まで、2010年秋からフィールドプロットに埋もれBDM映画を風化°暗闇の中でC 。 WG = WeedGuardプラス; BA = BioAgri。成長評価スキームについては、表1を参照してください。

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図1。 20Xの倍率で解剖顕微鏡下で見たとき、ステップ7で説明したプレートバイオアッセイにおけるBioAgriの腐葉土の植民地化。

図2。 FMMで68日後WeedGuardプラス腐葉土の外観ではなく、（）は接種、または暫定カエトミウム SPとして識別ZZを分離を接種。 （B）でかろうじて区別される導管の要素（矢印） に注意しますが、はっきりとBで見られる。いいえ成長が分離カエトミウム用FMM専用コントロールに見えませんでした。サンプルは、スパッタコーター定足数SC7640を用いて金/パラジウムでコーティングされ、そしてTescan VEGA 5136 MM SEMに15kVの加速電圧で撮像した。

図3液体バイオアッセイで68日後BioAgri腐葉土の外観。発芽胞子の単塊は暫定Sordariomycete（）として同定され、隔離ZZ用FMMのみのコントロールで観察された。 BioAgriのマルチ暫定的ペニシリウム属（C）、およびZZ（D）を単離すると共にインキュベートBioAgriの腐葉土として識別VVを分離を接種未接種FMM（B）、BioAgriの腐葉土でインキュベートした。サンプルは、スパッタコーター定足数SC7640を用いて金/パラジウムでコーティングされ、そしてTescan VEGA 5136 MM SEMに15kVの加速電圧で撮像した。

本明細書に記載された手順は、土壌から電位BDMのdegradersを単離するための第一パスの技法を表し、正常7ヶ月間土壌中に埋設BDMSから菌類を分離するために使用された。同じタイプの新鮮なBDM材に再接種時菌類は孤立菌類が本当に植民あったことを示す、とフィルムは真菌の増殖を阻害するではなかったこと、成長した。プラスチック分解菌や細菌の単離は、潜在的にプラスチックが分解する必要がある土壌や堆肥の改正のために、個別に、または組み合わせで、その使用につながる可能性があります。

母国土壌環境において、微生物種は単独では存在しません。プラスチックdegradersも貧栄養生物がBDMSに成長が、他の炭素及びエネルギー源を使用して、これらの反抗栄養源の植民地化のキーストーン種である可能性があります。 in vitroで BDM劣化を評価しますが、より良い本物の土壌microbiを模倣するための努力でアルコミュニティ、本明細書に記載された方法は、真菌や細菌の接種ではなく、純粋分離株よりも、混合物のテストのために変更することができた。

注目すべきは、TT、XX、VV、およびBDMSのYY達成最小限の劣化を分離しますが、それぞれのプレートと液体バイオアッセイの両方に見えるBDMの植民地化を示した。このように、目に見える植民地は必ずしもBDMポリマーの分解を意味しませんでした。 YY TT、XX、VV、そして、環境からだけでなく、BDM ^29,30,31から栄養分を得oligotrophsを表現する可能性が分離します。

真菌が炭素源として特定のBDMを使用していることを決定的な証拠は、化学的方法を介して劣化の測定を必要とする。 microogranismsを有するプラスチックのインキュベーション中の二酸化炭素の発生は、呼吸を示し、ポリマー故障^15,16,39の間接的な尺度として使用することができる。様々な方法が込み、ポリマーのサイズおよび構造についての情報を得るために使用される高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、示差走査熱量測定、熱重量分析、核磁気共鳴分光法、X線回折、およびフーリエ変換赤外分光法をuding。 CO ₂進化とポリマーの分解を評価するための研究は、本明細書に記載のスクリーニング手順から論理進行を表すでしょう。しかし、測定ポリマーサイズの化学的方法は、カビや細菌が成長中に分泌される有機酸による加水分解から酵素分解を区別することはできません。プラスチック内訳における酵素メカニズムの含意は、in vitroで分解するポリマーのできる純粋な酵素（複数可）の分離を必要とするであろう。

ここに記載されている手順では、食品包装材やゴミ袋など、フィルムコンフォメーションで使用されている任意のプラスチックのために広く適用可能であるべきである。これらの手順は、いくつかの利点を有する。まず、プラスチックフィルムはbioaで使用SSAYは、彼らの商業形態環境において、市場で購入し、最終的な分解として利用できます。警告はプラスチックを使用されていることを、本研究では2010年の成長期後に収穫BDMSのように、 インビトロのバイオアッセイで使用される新しいプラスチックフィルムよりも風化したかもしれません。以前は微生物の攻撃、UV、風、土壌微粒子によって摩耗、無機土壌のコンポーネントを経由して化学的加水分解、土壌動物相は、すべてのBDMのフィルム¹¹上の酵素作用の効率を変える、ポリマーの酸化と断片化に貢献しています。第2の利点は、この方法は、独自のプラスチック製品の個々の成分は、公知および/またはテストのために純粋な形態で入手可能であるか否かを用いることができることである。しかし、複数のまたは未知の成分とプラスチックを使用するの限界は、可視劣化が確実に単一成分に割り当てることができないことである。たとえば、 図3Dの劣化は、デンプンbを表すことができ"デンプン系" BioAgri膜中より反抗ポリマーの分解なしreakdown。デンプン改正プラスチックフィルムの中で、土壌劣化に関する以前の研究では、二酸化炭素の発生率は変わらず、ポリマーの分子量は、添加物ではなく、ポリマーは、微生物によって利用されていたという仮説を支持した澱粉と染料の量は、フィルムに追加反映^39。最後に、この手順は、このように、現在標準的な使用^15,16のものよりも定義されたシステムを提供し、in vitroでの分解に焦点を当てています。それは、化学的に定義された培地で劣化サンプルは土壌や堆肥に分解するサンプルよりも化学的方法を介して評価することが容易に証明することが期待される。このような評価は、この作業の現在の焦点です。

この手順は異なる我々と、米国内の3つの場所でBDMフィルムの4つのタイプ（TN、WA、およびTX）からBDM分解菌や細菌の単離に成功したather、土壌の種類、および微生物群集構造。この手順では、時の成長のための容量、およびBDMSの内訳と、個々の分離株に焦点を当てた、還元ビューを取る。しかし、結果は、貧定着菌の独立したリンク先の役割を説明するために、プラスチックフィルムの完全な分解の最終的な目標に重要であると予想される全てが真正な BDMのdepolymerizers、および他のコミュニティのメンバーを、微生物群集解析の重要性を強調するバイオマス、二酸化炭素および/またはメタン、及び水を含む。

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

博士スティーブン市会議員、デビッド葉、そしてエリンマクリーは感謝して顕微鏡で助けを認められている。この研究はNIFA特殊作物研究イニシアティブ、USDA SCRI-SREPグラント賞2009から02484番からの助成金で賄われました。ブリアナKinash、ケビンキンロック、ミーガンレオンハルトジョセフ·マッカラム、マリアMcSharryとニコールSallee、優れた技術支援と思いやりの議論を提供した。