齧歯尿生殖洞間充織とヒト幹細胞の組織の組換えを用いたヒト前立腺上皮の形成

前立腺癌の開始を根底早い分子機構を解明するために、斬新かつ革新的な人間のモデル系とアプローチが必死に必要とされている。ヒト前立腺上皮を形成するために、多能性幹細胞集団を誘導するプリ前立腺尿生殖洞間葉（UGSM）の電位は、前立腺研究における強力な実験的なツールである。

前立腺癌の研究の進展が著しく、前立腺疾患の開始を根底に遺伝的および分子事象を理解するために我々の能力を制限するヒト由来とホルモンナイーブモデルシステムの可用性によって制限されます。発癌ヒト前立腺を研究するための優れたモデルシステムの開発に向けて、私たちと他の人が胎児の齧歯類前立腺間質のユニークなプロ前立腺誘導可能性を利用している、尿生殖洞間葉（UGSM）が呼ばれる。このような胚性幹細胞などの特定の多能性細胞集団と再結合するとき、UGSMは、テストステロン依存的に正常なヒト前立腺上皮の形成を誘導する。例えば、ヒトモデル系を調査し、実験的に、典型的なげっ歯類のトランスジェニックの研究と比較して加速した候補前立腺がん感受性遺伝子の能力を試験するために使用することができる。ヒト胚性幹細胞（ES細胞）遺伝的に培養ボイジャーで変更することができるのでグラム誘導性遺伝子発現やsiRNAは前に組織の組み換えにベクトルをノックダウン、そのようなモデルでは、機能遺伝子の結果、または促進するか、または発癌を防止すると考えられている遺伝子の組み合わせを、テストが容易になります。

UGSM細胞の純粋な集団を単離する技術は、しかし、挑戦されており、頻繁に学習すると、以前の専門知識を持つ誰かが個人的に教えることが必要です。また、免疫不全宿主の腎被膜下細胞混合の接種は、技術的に挑戦することができます。ここでは、アウトラインと齧歯類の​​胚及びヒト前立腺上皮を形成するために、組織の混合物の腎カプセル注入からUGSMの適切な分離を示しています。そのようなアプローチは、その現在の段階では、胚性幹細胞の異種移植生体内で必要とし、将来のアプリケーションは、潜在的にインビトロ腺形成または人工多能性幹細胞集団（iPS細胞）を使用して含むことができる。

前立腺癌のより良い人間モデル系のための多大な必要性が存在する。具体的には、遺伝的に直接前立腺癌の開始において特定の遺伝子の役割を識別するために操作可能な通常の、非悪性前立腺組織の関連するヒトモデル系は非常に有益であろう。ゲノム時代の到来は、癌の形成において役割を有することができる多数の遺伝子を同定している。実験的な人間のモデルシステムの欠如は、しかし、深刻な機能的にテストし、候補前立腺がん感受性遺伝子を特徴づけるために我々の能力を損なう。理想的なモデルシステムは、適切なトランスジェニックげっ歯類モデル系と組み合わせて、癌感受性遺伝子の迅速かつより迅速な機能解析を容易にするであろう。さらに、このような人間のモデル系はへ新しい治療法の発見と検証に向けて発癌前立腺のシグナル伝達機構の分子特性解析を可能にする前立腺癌の形成を防止する。

ヒト胚性幹細胞（ES細胞）異種移植片のようなヒト前立腺組織を形成することができる。 2006年にテイラーらは 、ヒトES細胞は、8〜12週の期間内に齧歯類泌尿生殖洞間葉（UGSM）で再結合されたとき、生体内で前立腺上皮を形成するように誘導することができることを報告した^。1これらの研究はで以前の研究に基づいていたその齧歯胚UGSMを示すクーニャラボは、幹細胞とin vivoでの胚上皮細胞集団の前立腺分化を促進することができます^。2,3前立腺は、尿生殖洞（UGS）と呼ばれ、前胚17日（にマウスE17胚原基から開発;ラットにおける日E18）UGSを除去することができ、物理的に上皮（UGSE）と間葉（UGSM）に分割⁴この組織換えアプローチはかなり特定の前立腺の開発と発がんの我々の理解を、強化しています。LYの成長因子、ホルモンシグナル伝達経路と前立腺間質と上皮の間の分子の関係^。5-8この方法は、幹同一または異なる種からの上皮細胞とUGSMのex vivoでの組み合わせを含み、これらの細胞/組織組換え体を移植し、栽培されているとマウスのホスト内の異種移植^。4,9 生体成長の期間の後、インプラントは、間質組織に埋め込 ​​まれている前立腺上皮腺構造が含まれています。さらに、染色は、そのような構造が本当に前立腺とヒト由来のかどうかを判断するために実施することができます^。10,11

この研究は米国国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関する指針の勧告に厳密に従って行った。プロトコルはシカゴインスティテュー動物実験委員会の大学（IACUC、プロトコル番号72066および72231）によって承認された。すべての手術麻酔下で行い、すべての努力を最小限に抑えるために苦しんで行われた。ヒト胚性幹細胞株WA01（H1、NIH登録＃0043）がmTeSR1メディアを使用してフィーダーに依存しないプロトコルを使用してWiCell（マディソン、WI）、培養から取得しました（電池技術を幹、バンクーバー、BC）。 ES細胞を解凍通路10内で使用された。

1。マウスまたはラット胚から尿生殖洞の分離

1. 5分間のCO ₂吸入によりタイムアウト妊娠マウス（日17.5）またはラット（日18.5）を安楽死させる。死亡は、ラットにおけるバイタルサインの停止によって確認される。その後、人道的にその首を破る。 Rにおいては、この時点で安楽死させている。腹部皮膚及び脇腹を殺菌するために70％エタノールを散布。腹部の皮膚や筋肉の層をカットした後、子宮を切った羊膜嚢からラット胚を分離し、へその緒を切った。氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を含む50ミリリットルファルコンチューブに胚を移し、氷上に保つ。胎児は、外科はさみで断頭により安楽死させる。
2. 100ミリメートルペトリ皿に胚を置きます。臍（ 図1A）のレベルでハサミで胚を二等分する。胃や小腸を取り外します。雄の胚（ 図1B及び図1C）の女性胚と精巣で卵巣を明らかにする。 （卵巣は腎臓の尾極に配置されています。精巣、膀胱のレベルで約です）。この発達段階では、両方の男性と女性の胚から単離さUGSMは、ホストの存在下で前立腺上皮系統を誘導することができるテストステロン^。4この発達時点の後、しかし、前立腺芽がUGSMに形成し始め、純粋UGSMの分離は非常に困難である^。4
3. 解剖顕微鏡下で、膀胱と腹部の後壁を公開するVannasはさみで真ん中のラインで腹壁をカット。添付ファイルから無料アッパー生殖（オス胚における、尿管、ウォルフ管とミュラー管をカット、女性胚において、尿管とミュラー管をカット）。臍帯から膀胱を解放。恥骨とデュモン細かい先端の鉗子との泌尿生殖洞の前壁からぶっきらぼうに別をカットします。最後に、直腸から泌尿生殖洞の後壁を分離。下端（尿道から）で、膀胱と尿生殖洞をカットし、氷冷HBSSで泌尿生殖洞を一括します（膀胱）を格納する。

2。尿生殖洞間充織の分離

1. 解剖顕微鏡（ 図1D）の下尿生殖洞から膀胱を削除します。
2. 1％のカルシウムでトリプシン（のCa ^{2 +）}とマグネシウム（Mg ^{2 +）}自由HBSSを含むファルコンチューブに尿生殖洞を転送します。 75分間、4℃の冷蔵庫にチューブを置きます。
3. トリプシンを取り外し、DMEM/F12培地中で、10％胎児Bovin血清（FBS）をトリプシンを中和。
4. 慎重に針またはデュモン細かい先端鉗子（上皮管をそのまま維持すると上皮チューブから粘着性の間葉スリーブをいじめることは間葉の上皮細胞の混入の可能性を減少させ、これはあなたの幹細胞由来のヒトと一緒に形成する齧歯類腺になることが腺上皮）（ 図^1D）。12
5. + 1％非必須アミノ酸（NEAA）プラス1nM​​のR1881; DMEM/F12培地+が10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（0.5 mg / mlのペニシリン/ストレプトマイシン）を含む新たなファルコンチューブにUGSMを移す。 PLエース37℃のインキュベーター内チューブ5％CO ₂で一晩。
6. 200 xgで組織を遠心分離し、上清を捨てる。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（組織ペレットを乱さないでください）​​で洗ってください。
7. 再懸濁する組織に0.2％コラゲナーゼ（DMEM/F12で）を追加します。 1時間穏やかに揺れて37℃でインキュベートする。
8. 精力的に渦消化組織三回、それは均質な単一細胞混合物となり、コラゲナーゼを中和するDMEM/F12培地+ 10％FBS + 1％P / S + 1％NEAA + 1nMのR1881を追加するまで。
9. 200×gで遠心分離した後、HBSSでUGSM細胞を再懸濁することにより洗浄し、完全にUGSMを洗浄を3回繰り返します。最後DMEM/F12に間葉細胞を中断し、血球や細胞計数装置を用いて細胞を数える。
10. Accutase消化（;ビルリカ、MAミリポア）を使用して; mTeSR1メディア（バンクーバー、BC電池技術を幹）とのフィーダーフリーのプロトコルを使用して培養ヒトES細胞を解離する。ヒトES細胞を洗浄暖かいDMEM/F12メディアで彼らの成長のログインフェーズ中に、その後暖かい1X Accutaseソリューションを追加して、単一の細胞がコロニーから一様に解離されるまで15〜20分間37℃でインキュベートする。 Accutaseを中和し、穏やかにピペッティング上下細胞塊を混合し、分割するために、1xの定義されたトリプシンインヒビター（グランドアイランド、NYインビトロジェン）の等量を追加します。ピペット200×gで3分間遠心チューブと遠心分離機への細胞、およびDMEM/F12メディアで再懸濁細胞ペレット。 200が再びxgで3分間、チューブを遠心し、上清を除去し、次いで、所望の音量で冷たいHBSSまたはDMEM/F12で再懸濁する。
11. ヒトES /間葉系細胞の1:2.5比hES細胞を追加します^。3これは、10ミリリットルの注射あたり4E ⁴ヒトES細胞と1E ⁵ UGSM細胞（シングルラットUGS 2E ⁶間葉細胞について通常利回り）の細胞組成になります。 5分間200×gで遠心分離した後、上清を捨てる。 75％マトリゲル（BD Biosciences社、と再懸濁サンノゼ、カリフォルニア、扱いやすくするために25％の冷たいHBSSと混合）とサブ腎カプセル注入のため氷の中にチューブを置きます。

3。腎被膜の下に組換え組織の移植

1. 無菌手術領域を準備します。
2. ケタミン/キシラジンIPを持つ男性の無胸腺ヌードマウスを麻酔、ケタミンの1時01分08秒の比率を含む新鮮なミックスを使用：キシラジン：生理食塩水。投与は100 mg / kgでケタミンおよび2.5 mg / kgをキシラジンなります。つま先ピンチに反応しない動物は、完全に20〜30分間の下でなければなりません。
3. 外科ベタジン溶液及び外科用ドレープを適用することにより、続いて70％のアルコールの3交互ワイプでクレンジング、手術部位を（ヌードマウスを使用していない場合）シェービングでマウスを準備します。
4. 麻酔中の乾燥を防ぐために、マウスの目に目水分軟膏（Altalube眼軟膏）を置きます。
5. 手術中に、マウスの呼吸速度および中核体温が監視される。呼吸速度笙40-90回/分以内に安定して維持される自民。中核体温は、粘膜と足の裏ピンクの色を観察して監視される。
6. 背面に1.0センチメートル長い縦皮膚切開を行います。 0.5センチメートル縦切開で腹壁をカットし続けています。
7. 優しく腹部の腎臓を絞り出す、滅菌生理食塩水の滴を使って腎臓の表面を湿った状態に保つ。
8. そっと穿刺空の27ゲージ注射針を使用して腎カプセル。非常に浅い穿刺で十分です。あなたの携帯電話、混合物を注入するためにあなたの鈍針を挿入してここは次のようになります。
9. あなたの細胞混合液10μlと28ゲージの鈍注射針を埋める。ゆっくり穿刺部位を挿入し、腎被膜下の領域に到達するために腎臓実質貫通している。腎被膜下に腎臓にボーラスを形成する細胞の混合液10μlを注入します。撤退針。
10. ABDOに腎臓を返す端末空洞。 4-0ナイロン縫合糸で腹膜の筋層を固定します。
11. 縫合糸またはステープルのどちらかで皮膚を閉じます。
12. 滅菌生理食塩水を使用して皮膚から血液をきれいにします。

4。術後鎮痛とモニタリング

1. 術後の痛み、37 1mlのを管理するためにブプレノルフィン（0.1 mg / kgを12時間毎）、又はケトプロフェン（生理食塩水で3〜5 mg / kgを12時間毎）で動物を注入℃の生理食塩水を腹腔内に動物を暖かく保つために脱水を防ぐ。
2. 清潔なケージに動物を入れて、マイルドな加熱パッドの上に置きます。
3. 彼らは意識を取り戻し、ケージ内で移動された後、動物の部屋に戻って動物を送信します。
4. 次の3日間、病気や感染の予想外の兆候を毎日動物を観察します。マウスは、食料や水術後1日のアクセスを含むケージでの活動の観察と監視されています。マウスが少ない活動を表示すると、ケトプロフェンは腹腔内広告です一日一回再び仕え。
5. 皮膚ステープルまたは縫合糸2週間後に手術を取り外します。
6. 異種移植組織は8週間後の手術は早くも収穫することができる。異種移植片は、小動物超音波（ 図2A）と、固定組織を用いたin vivoで画像化することができる免疫組織化学（ 図3）を用いて種々のタンパク質のための切片で染色することができる。

、私たちの研究室では、一般的に使用されるH1（NIH-指定WA01、遺伝的に男性）は、ヒト胚性幹細胞株を用いて移植プロトコルを開発してきましたが、この行は厳密に品質管理のためにテストされています^1。テイラーらの刺激的な報告書に構築および核型正常である^13が適切に培養し、ヒトES細胞を維持拡大し、フィーダーフリー培養法（幹細胞技術を経由して、市販のフィーダーフリーシステム、バンクーバーBC）を使用して未分化多能性の状態で凍結保存することができます。図^14は、当社のプロトコルは、E18ラットUGSMの単一細胞懸濁液と組み合わせると成人男性免疫不全マウスの腎被膜下に注入されたヒトES細胞の単一細胞懸濁液を採用しています。重要なコントロールとして、USGMはヒトES細胞はUGSMフォーム大奇形腫（ 図2B）せずに移植しながら、識別可能な成長をもたらしていないだけでは移植した。我々の経験では^15を 、インプラント組織の80％以上との時間の80％（1ミリメートルから5ミリメートル〜8週間のサイズ範囲の後、上堅固な成長のUGSMプラスヒトES細胞の結果を再結合しながらラット上皮細胞組織の成長では決して結果を汚染することなくUGSMのATION、 ）腺上皮を含む。ヒトES細胞とUGSMの両方を含有する組換え体において、早期の腺形成は4週間後に観察し、8週間後に完全に形成され、前立腺特異抗原（PSA）陽性ヒト前立腺上皮（ 図3）が形成されている。これらの腺はアンドロゲン受容体（AR）陽性ホスト去勢後1週間存在しない腔-分泌細胞が含まれています。重要なのは、これらの腺はヒト特異的および前立腺特異的タンパク質PSAのための陽性である。このような人間の腺彼らは前立腺癌特異的マーカーであるα-メチルアシルアセチルCoAラセマーゼ（AMACR）は、発現しないので、非悪性であることが表示されていること、さらに、染色文書¹⁶

ether.withinページ= "常に">
図1。 E18.5ラット胚から尿生殖洞の分離。 A. E18.5ラット胚。白の実線は胚を二分する立場を示している。B. E18.5雄ラットの胚。黒の点線は、膀胱、尿生殖洞、直腸、および開発精巣を示す。C. E18.5雌ラット胚を。黒の点線は、膀胱、尿生殖洞と子宮を示す。D.膀胱と尿生殖洞はE18.5ラット胚から削除。しばらく実線は膀胱を削除する位置を示します。黒の点線と白矢印上皮管を示す。白い矢印ヘッドは尿生殖洞の間充織を示す。

7/50327fig2.jpg "ALT ="図2 "のfo：コンテンツ幅=" 4インチ "FO：SRC =" / files/ftp_upload/50327/50327fig2highres.jpg "/>
図2。超音波イメージングとUGSM及びヒトES細胞由来生体組織の異種移植片における総形態。成長異種移植片のA.超音波イメージングは、実験の過程でライブ動物の分析を可能にします。イメージはVEVO 2100小動物超音波（;トロント、ON Visualsonics）を使用して8週間後に手術を捕獲された。 。丸で囲んだ領域は腎臓表面の成長、組織の異種移植片を表した実験のエンドポイントではB.、ラットUGSM（rUGSM）と組み合わせたヒトES細胞は、腎臓の表面（ 左パネル ）に見える組織の塊を形成し、ヒトES細胞は、単独の移植などの大きな奇形腫を形成（ 中央のパネル ）と予想、そして単独の移植UGSM任意の識別可能な構造（ 右パネル ） を形成することができない。

。JPG "ALT ="図3 "のfo：コンテンツ幅=" 6インチ "FO：SRC =" / files/ftp_upload/50327/50327fig3highres.jpg "/>
図3。ヒト胚性幹細胞株WA01（H1）。ES細胞からヒト前立腺上皮の形成は、齧歯類UGSMと再結合し、無傷の雄ヌードマウスの腎臓の被膜下に移植した。 8週間の成長期間の後、ヒト前立腺腺上皮はAR、p63の、人間が制限されたPSA染色によって記録されるように形成されている。ホスト去勢後に一週間では、AR陽性、PSA陽性腔の層が特徴的アンドロゲン依存性を文書化、存在しません。 AMACR染色の欠如によって示されるように、前立腺組織が非悪性である。また、CHRA陽性神経内分泌細胞が検出可能であった。非悪性のヒト前立腺組織は、AR、PSA、およびp63のためのコントロールとして用いた、前立腺腫瘍、癌特異的AMACRの陽性対照として使用した。

UGSMを用いて組織の組換えは、前立腺および前立腺癌の開始につながる分子事象の開発を調査するために非常に便利なテクニックです。 UGSMの誘導電位が前立腺研究の多くの用途に用いられてきたが、これらは増強腫瘍間質上皮相互作用を研究し、異種間前立腺組換え体を形成し、前立腺細胞株および腫瘍を取る含むUGSMの^7,17-20適切な製剤。しかし、げっ歯類上皮は腺形成になり、結果を混乱させることができます汚染などの実験成功に不可欠です。したがって、UGSEからUGSMの分離（ステップ2.4​​）遠くて、プロトコルの中で最も重要で、最もトリッキーなステップです。このような汚染を制御するには、種間で識別する技術を使用することを強く奨励し、同様にされて蜂巣からの腺形成を文書化しないために単独UGSMを使用して、追加の実験的なアームrの汚染物質¹²

フィーダーフリーのhES培養試薬および方法の最近の開発は純粋な集団ヒトES細胞は、培養された拡張および凍結保存することができます^。14はまた、レンチウイルス遺伝子送達の利用拡大は、目的の遺伝子の安定したゲノム組み込みと発現を可能にする^。21,22これらの組み合わせの進歩は前立腺胚UGSMの誘導可能性と組み合わせた場合、純粋なヒトES文化の遺伝子操作を可能にすると、関心のある特定の遺伝子を発現するヒト前立腺腺の生体世代で許可されます。さらに、この技術は、成人のホストからと遺伝的に修飾された細胞に由来する誘起多能性幹細胞株（性IPSC）の影響を受けやすいだろう。定義されている蛋白質を使用して^23,24、我々は、そのようなヒトES細胞由来のヒト前立腺上皮を示す大人に非常に似て見えるヒト前立腺上皮が、グローバル分子レベルにあると確信してあります考慮しなければならない遺伝子発現に多少の違い。これを考慮して、研究者らは、拡張されたサンプルサイズを使用し、成人のヒトの組織と比較して、それらの組織の分子プロファイルを検証するために、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）ベースのアプローチと比較遺伝子発現解析のプラットフォームを考慮する必要があります。それにもかかわらず、連続的に培養し、フィーダーフリー幹細胞株を用いたヒト前立腺腺上皮の形成は、前立腺癌の関数と開始に係る多数の分子生物学的研究を促進する可能性がある。

我々の技術は、アプローチを選別レンチウイルス感染および流れの使用、並びにセルラー量のより正確な制御を可能にする、UGSMおよびヒトES細胞の両方の単一細胞懸濁液を利用する。しかし、これはUGSMの誘導の可能性を減少させることができる。別のアプローチは、コラゲナーゼ消化前に、非解離UGSMを（ステップ2.5の後に）使用してきました）とコラーゲン溶液内でES細胞、または埋め込 ​​み細胞と直接インキュベーション^4は腎被膜下に、これらの組織を移植するために、代替技術は腎カプセルに切開をすることであろう、上に腎被膜下に小さなポケットを作成腎臓の、物理的にそのポケット内細胞塊を配置します^。4,20

著者は提示仕事に利害の対立がありません。

我々は博士Arieh Shalhav率いる泌尿器シカゴセクションの大学、泌尿器研究博士キャリーRinker-シェーファーのディレクターの支持を認めるたい。また、博士ミシェルルボー率いるシカゴ総合がんセンター（UCCCC）大学の支援に感謝します。また、博士マークリンゲン率いるヒト組織リソースセンター中核施設、レスリーマーティンとメアリージョーフェケテの支援を専門的技術支援に感謝するとともに。またテリー李が運営免疫中核施設に感謝します。米国癌協会制度研究助成（ACS-IRG、＃IRG-58-004）;;がんセンターサポートグラント（P30 CA14599）;ブリンソンこの作品は外科シカゴ科、泌尿器科のセクション大学によって資金を供給された財団;アルビンバウムファミリー基金、シカゴ大学のがん研究財団女子会; S.クレーゲルはHHMIでサポートされています：マックに - 卒業生フェローヒップ（56006772）とがん生物学トレーニンググラント（T32-CA09594）。最後に、私たちは原稿の彼らの重要な評価のためにロバート·クラーク博士VenkateshKrishnan、とネイサンStadickに感謝したいと思います。