マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

Lensfree光トモグラフィーは、<1μmの空間分解能を提供して三次元顕微鏡技術である×<1ミクロン×15〜100ミリメートルの大型イメージングボリューム上のそれぞれx、yおよびz次元において<3μmの ^3。

それは、異なるサイズのスケールのオブジェクトに関しては3次元（3D）構造の情報を提供することができるように断層イメージングは​​、医学で広く使われているツールでした。マイクロ波·ミリスケールでは、光学顕微鏡のモダリティは、可視光の非電離自然に増加する使用により、検索、および豊富な照明ソースのセット（例えば、レーザや発光ダイオードなど）と検出素子（などの可用性ラージフォーマットCCDとCMOSディテクタ·アレイ）​​。最近開発された光断層顕微鏡のモダリティのうち、一つは光コヒーレンストモグラフィー、光の回折トモグラフィー、光学投影トモグラフィと光シート顕微鏡を含めることができます^。1月6日これらのプラットフォームは、細胞、微生物やC などのモデル動物の断面イメージングを提供します線虫 、ゼブラフィッシュとマウスの胚。

既存の3D光学イメージャは、一般的に目を制限する、比較的大型で複雑なアーキテクチャを持っているeは、高度な研究所にこれらの機器の可用性、およびラボオンチッププラットフォームとマイクロ流体チップとの統合を妨げる。別の断層顕微鏡を提供するために、我々は最近⁷ LOTを破棄レンズやかさばる光学部品の使用。高スループット、コンパクトでコスト効率に優れた光断層撮影法としてlensfree光トモグラフィー（LOT）を開発し、代わりにマルチアングルに依存しています照明と大型撮像ボリューム上のマイクロオブジェクトの深さ分解イメージングを達成するためのデジタル計算。 LOTは、のx <1μmのX <3 15〜100ミリメートルの³大撮像ボリューム上のそれぞれx、y、およびz寸法の程度、、とすることができ、特に有用<1μmの空間分解能で画像生体試料缶ラボオンチッププラットフォーム。

1。イメージングセットアップ

LOTは、小型·軽量の携帯型アーキテクチャ⁸に組み立てることができるし、あるいは断面の撮像能力を持つoptofluidic顕微鏡として⁹本報告では、しかし、我々は静的断層に向かってベンチトップ型の実装の ​​ための基本的なイメージングセットアップについて説明します。サンプル。

1. 照明モジュール：LOTでは、このような発光ダイオード（LED）のように部分的にコヒーレント光源を利用することができます。実験的な柔軟性を高めるために、我々は、キセノンランプ（コーナーT260、ニューポート（株））とモノクロを使用していました。モノクロは、 例えば 450から650 nmの中心波長の周り〜1月10日波長スペクトル幅と出力を提供するために調整した。この部分的にコヒーレントな出力は、システムへの部分的コヒーレント光を実現するマルチモード光ファイバ（Thorlabs AFS105/125Y）に結合されている。
   光ファイバは、（Thorlabs電動回転ステージに搭載されているPRM-1Z8は、照明の角度を変更するには）Thorlabs TDC001コントローラによって駆動されます。接続された光源と電動ステージは、与えられた角度で光源の面内シフトを達成するために使用された二次元リニアXYステージ（ニューポートILS50CCニューポートMFA-PPDコントローラによって駆動される）上にマウントされています。
2. 検出：Lensfree光トモグラフィーは、検出器アレイが大幅に画像取得ステップまたはデータ処理を変更せずにアプリケーションの要件に応じて選択することができるようなスケーラブルなテクノロジーです。本稿では、2.2μmのピクセルサイズ（IDSイメージング、UI-1485LE-M）で、5メガピクセルを有するCMOSセンサアレイを採用しています。検出器は検出器のアクティブ領域の上に直接置かれた試料の広い視野（ 例えば 24ミリメートル^2）ホログラフィック画像を記録するために使用されます。デュアル軸断層撮影法のセットアップが実装される⁷である場合、検出器はすべきLSOは光軸に垂直な平面で（一緒に検出器付き）のサンプルを回転させるために水平方向（光学テーブルに対して）回転ステージ（ 例えば Thorlabs RP-01）に搭載される^7。

2。試料調製

lensfree光トモグラフィーは、画像などの細胞や微生物などのオブジェクトの様々なことができますが、我々はCの三次元顕微鏡法を行うことにより、基本原則を説明しますelegansのサンプル。

1. メスやヘラを使用して、Cを含むペトリ皿から寒天の小片を取る虫の文化。各次元に沿って数mmの立方体の部分は線虫の何百ものが含まれています。
2. 1ミリリットルの脱イオン（DI）水を含有するポリプロピレン製のバイアル中に寒天の小さなチャンクを配置します。
3. 穏やかに30秒〜1分間ボルテックスし、ワームはDI水に寒天片から這い出しまで10〜15分間待ちます。
4. するために一時的に、ワームを固定する5から10 mMのレバミゾール溶液（Sigma-Aldrich）を1 mlを加え、10分間待ちます。
5. ピペット5月10日バイアルの底からのサンプルの添加、および2つのカバースリップの間にサンドイッチ。このサンプルは、一時的に固定化されたワーム（ 例えば 50から100ワーム）の多数を含む、データ収集を開始するには、検出器上に配置することができます。

3。データ収集

ここでは、LabVIEWインタフェースを開発したカスタムを使用して自動化された典型的なLOT実験のための画像取得の手順をまとめたものです。

1. 0°は、光源の垂直方向の位置に対応して-50℃に回転ステージの初期角度を調整します。
2. ホームポジションであるXYステージ（0,0）の初期位置を調整します。
3. 最高の画像が任意のsなしでできるだけ明るくなるような、そのダイナミックレンジを活用して、検出器の露光時間を調整するaturatedピ​​クセル。
4. 回転ステージの角度を変えずに、9枚の画像をキャプチャします。各画像については、各画像は以前のものと比較してピクセルの約4分の1だけシフトするような3x3の正方形のグリッド内の新しい位置にXYステージを移動します。 6μ6グリッド、 例えばそれぞれの角度で複数の画像を、取得、オブジェクトの種類と信号対雑音比（SNR）に応じて分解能を向上することがあります¹⁰
5. ホームポジションであるXYステージ（0,0）の初期位置を調整します。
6. +50℃に到達するまで、2°刻みで回転ステージの角度を大きくします。各インクリメントした後、それぞれの新しい角度で、すなわち 、手順3-5。角度の増分は、取得時間と画像解像度の最適化に応じて細かいまたは粗いことができます。
7. （デュアル軸断層撮影方式が利用される場合はオプションの手順）検出器は90°でマウントされている水平方向のステージを回転させます。その後、手順1〜6を繰り返します。

4。データ解析

第3節の手順1〜6に続いて、459の画像のセットは、照明の51の異なる角度の各9つのサブピクセルシフトした画像が含まれ、取得されます。まず、9枚の各セットは、デジタル角度ごとに、高分解能（HR）投影ホログラムを得るために、ピクセルの超解像アルゴリズム^10を使用して、処理されます。それは、画素超解像はlensfree画像の空間分解能ではなく、回折限界ではなく、画素サイズの制限を克服することを指すことに留意すべきである。画素超解ホログラムは、その後デジタル51投影画像を得るために^7月10日再建されています。 51投影画像のこのセットは、ImageJの（オープンソースの画像解析ソフトウェア）のTomoJ、プラグインを使用して、バックと予測されています^。11この逆投影操作は、サンプルの三次元画像（断層像）を出力します。ここで実装されていませんが、文献に記載されたデュアル軸断層撮影方式も利用することができます。 7。この方式では、断層の2番目のセットは、サンプルに関する詳細な空間情報を提供し、軸方向の分解能を向上させる第1回転軸、に関して直交する軸に沿って光源を回転させることによって得られる。

5。代表的な結果

大lensfreeの視野（FOV）光トモグラフィーを図1に示されています。試料は検出器アレイの上に直接配置されているように、オブジェクトのホログラム画像は、さらに大きいのアクティブ領域と新興の検出器アレイを使用して増やすことができます24ミリメートルの² FOV、以上記録することができます。

検出器アレイのピクセルサイズが記録されたホログラフィック画像の解像度を制限していますが、画素超解像技術は、この問題を軽減します。 図2に示す画素超解ホログラムに沿って照明の3つの異なる角度のサブミクロンの空間分解能を提供する再構成画像（ すなわち投影画像）に設定しています。

投影画像は、検体の断層像（ すなわち、3次元画像）を計算する（ 例えば、フィルタ逆投影）の断層画像再構成技術を使用して組み合わせることができます。 図3は、ワームの前を通してxy平面上で3スライス画像を示し、ここで咽頭チューブは、約5μmの外径がこのほぼ円筒状の構造から予想されるZ =8μmのを通じて、スライスでのみ表示されます。また、xz平面における断面像（ 図3上部パネルの挿入図）を明確に咽頭の正常な3Dイメージングを実証し、ワームや咽頭チューブの内側（矢印で示される）の境界を示しています。

図1は、lensfree光トモグラフィー（LOT）垂直照明のセットアップを使用して記録されたフルフィールド·オブ·ビュー（24ミリメートル^2）ホログラフィックイメージを示しています。 LOTの大きな撮像面積のおかげで、多くのワームが同時に単一のデータ取得ステップで撮像することができます。

図2は、超解ホログラム（左パネル）とデジタル再構成された投影画像（右パネル） でのピクセルを示しています。つの異なる照明の角度で線虫ワーム（大きな視野からトリミングされている）。各投影画像は、フィルタ逆投影操作で3次元構造の計算を可能にする別の視野角を、についての情報が含まれています。

図3は、Cの計算された断層を示しています。 虫ワームOfは図2。 （上段）は、z = 3μmで全体のワームのスライス画像を示しています。挿入図はワームの前から断面画像を示しています。はめ込みのスケールバーは50μmである。 （下段）lensfree光トモグラフィの光学切片能力を発揮し、ワームの前までの3スライス画像を表示します。図全体の矢印は、ワームの咽頭チューブ上の同じ点を示しています。顕微鏡像（X40、0.65-NA）も視覚的に比較するために提供されています。

それはlensfreeオンチップ·ホログラフィック顕微鏡のユニークな形状が画素超解像と断層イメージングを実現するための重要なイネーブラであることを強調することが重要です。撮影した画像は^、12に近づくと支離滅裂の接触イメージングのように、投影画像であると仮定されていませんが、 投影ホログラム 、透過光の回折、それが検出器に入射するまでは、デジタルホログラフィック再構成によって修正することができるので。したがって、サンプル·ツー·センサの距離の変動は考慮されることができます。サンプル·ツー·センサーの距離は、通常〜0.5〜5ミリメ​​ートルであるため、光源は、試料から〜4〜10センチメートルの距離に配置されている間また、サブピクセルシフトを達成することは大きなソースシフトを必要としません。結果として、唯一の50から100μmで光源を移動すると、iの望ましくない変動を防止するため、検出器面にサブピクセルシフトを達成するのに十分である）照明方向/視点、ND ii）各ソースの位置で効果的なサンプル·ツー·センサーの距離。阻止されていない場合は、これらの変化は、画素超解像画像の重要な異常を引き起こす可能性があります。したがって、特定の角度で、各ソースの位置に記録されたホログラムは、実際には同じホログラフィック画像のサブピクセルシフトしたバージョンであると考えることができる。また、lensfree光トモグラフィーのほとんどアライメントフリー設計は、単に光源^7,9を回転させたり、さまざまな角度⁸で複数の光源（例えばLEDなど）を使用して、異なる角度で投影ホログラムを記録することがむしろ簡単です。

LOTは、サンプルのオンチップイメージングのための大規模な空間帯​​域幅積を提供して新興の技術です。重要なのは、それが大幅に次世代の検出器アレイの恩恵を受けるスケーラブルなテクノロジーです。つまり、高密度画素で高速CMOSとCCD検出器アレイが使用可能になった、LOTは、コンティうとしてnuously解像度、視野とスピードの両面を向上させます。これは、デジタル技術の進歩で画質の直接的なスケーリングを妨げ、結像性能は、複数のサブシステムによって決定され、従来の光学顕微鏡、上lensfreeオンチップの顕微鏡の重要な利点である。

要約では、大きな撮像ボリューム上の試料のハイスループット3次元顕微鏡を可能にする、コンパクトなアーキテクチャでは、lensfree光トモグラフィーは、ラボオンチップシステムのための有用なツールセットすることができます。

利害の衝突が宣言されません。