内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

ここでは、直接マウス皮質でmicroregional組織低酸素を可視化する方法について説明します。。それはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）と皮質微小循環の同時二光子イメージングに基づいています。このメソッドは、組織の酸素供給の高解像度解析に有用である。

代謝需要の高いレベルで機能するために脳の能力は、血流と組織の酸素拡散を介して連続的な酸素供給に依存しています。ここでは、直接microregional組織低酸素を視覚化するとマウスの皮質に血管周囲の酸素勾配を推論するために可視化する実験的方法論のプロトコルを提示します。それはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）内因性の蛍光強度および組織NADH蛍光が急激に10 mmHgの¹以下の組織の酸素濃度で増加が観察組織の酸素分圧との間の非直線関係に基づいています。我々は、テキサスレッドデキストランとは対照的に本質的なNADH組織の蛍光と血漿の同時励起を可能にする740 nmの二光子励起を使用しています。既存のアプローチに比べてこの方法の利点は次のようなものがあります：それは本質的な組織信号を活用し、 生体内 IM の標準的な2光子を用いて行うことができます。機器のエージング、それは〜50μmの深さ分解能で視野全体での継続的な監視を可能にします。我々は、脳の血管から遠い脳組織領域が血管の酸素供給の減少は、次の機能が低酸素状態になって最初にある脆弱な流域に対応して示しています。このメソッドは、イメージmicroregional皮質酸素1つのことができ、したがって、脳血管疾患と脳卒中の不十分なまたは制限され、組織の酸素供給の役割を調べるために有用である。

1。イメージングのために動物を準備する

注：私達は大人のC57BLマウスを使用しています。異なるトランスジェニック系統は、研究課題に応じて使用することができます。血管手術やパルスオキシメトリーは、白い毛皮を持つマウス（例えば、FVB株）で促進される。

1. ベンチで手術部位を準備します。すべての手術器具は、70％エタノールでオートクレーブまたは消毒する必要があります。
2. 直腸プローブを挿入し、連続して作業中の動物の体温を測定する
3. 当初は5％イソフルランを使用して、マウスを麻酔。 15から30年代に、動物が移動されていない場合、加熱パッド（37℃）上に配置し、イソフルラン1.3から1.5パーセント）を含む空気の連続的な配信のためのフェイスマスクを適用します。動物は痛みの刺激（例えばテールピンチ）に応答していないことを確認してください。
4. 乾燥した空気への暴露を防止するために、マウスの目をカバーするために人工涙液ゲルを使用しています。
5. 電気かみそりを使用して、髪fを削除するROMの頭を、両方の太ももから。 2分間腿に毛リムーバー（例えばNairさん）を適用し、残りの毛を除去するために慎重に拭いてください。この太ももは、酸素飽和度測定のために使用されます。
6. 10パーセントポビドンヨード溶液および70％エタノールを使用して頭皮を消毒する。

2。開いた頭蓋骨頭蓋窓の準備

1. 頭蓋骨の尾5ミリメートルを開始し、はさみで頭皮の切開を行い、1センチメートルを進める。頭蓋骨を露出する側面に皮膚を移動します。
2. 頭蓋骨の上に膜を除去するために頭蓋骨の上から10％塩化第二鉄溶液を適用します。過剰の溶液を払拭し、45°の角度＃5ピンセットで離れて膜を落とす。それはヘッドプレートがしっかりと頭蓋骨（ステップ＃4から6）に取り付けることができることを保証するために、慎重にサイトを準備することが重要です。
3. 解剖顕微鏡を使用して、関心のある領域を識別します。頭蓋縫合が頭蓋骨cのために避けるべきであることに注意してくださいこれらの線に沿って予想外に折り返されます。
4. ヘッドプレートのウィンドウ（図1）のエッ​​ジの周りの急激な接着剤の薄い層（例えば、ロックタイト454）を適用します。関心領域は、ウィンドウ内で公開されるようにヘッドプレートを置きます。ヘッドプレート上の光の圧力を適用します。急速に接着剤を重合するための歯科用セメントの少量を適用します。接着剤が重合されている間に10秒間保持します。
5. ヘッドプレートと頭蓋骨を密封するためにウィンドウの端に急速な接着剤の少量を適用します。解剖のスコープの下に動物の所有者にヘッドプレートをネジ止めします。
6. 6000 rpmとIRF 005ドリルビットで設定されMicrotorque IIのドリルを使用して、頭蓋骨から、ヘッドプレートからすべての余分な接着剤を除去します。それ以外のガラスカバーの取り付けと干渉するので、ヘッドプレート上に残っている接着剤は、削除する必要があります。
7. 1000rpmでドリルをセットし、ヘッドプレートウィンドウ内で円を作ることによって頭蓋骨をドリル開始、直径〜5メートルメートル。あなたは非常に柔らかい鉛筆で描画されているかのように光抜本的な動きを使用しています。圧縮空気を使用して、骨塵を除去するためにすべての20〜30秒ドリルを停止します。
   注：ヘッドプレートの開口部の形状は円形の頭蓋ウィンドウを作成することが容易にドリルビット（左と右利きの外科医のために）のための追加のアクセスを許可します。さらに、2つの奇妙な形の穴が追加のポーラログラフィーや電気生理学的測定のための頭蓋窓の下に脳組織にクラーク電極やガラス電極を挿入するために必要なスペースを提供しています。
8. 掘削が進行するにつれて、巣穴は、中心にそのまま頭蓋骨の周りに形成されています。薄く頭蓋骨を通して突くことではなく、均一な厚さのこの巣穴を作るためないように注意してください。大血管、それらが損なわれないと、可能であれば、あっても触れてはいけません周りに余分に注意してください。
9. ウィンドウの中央に（ "落とす"）骨を持ち上げるためにピンセット＃3のいずれかの "脚"を使用します。 artificのドロップを適用します。ウィンドウのIAL脳脊髄液（ACSF）。
10. 柔らかいティッシュペーパーの角を（例えば、キムワイプ）を使用して、ACSFを拭きます。通常硬膜は、ウィンドウの縁の周りつまたは複数の場所で破損しています。これらのサイトのいずれかから始まるが、そっと持ち上げ、45°の角度ピンセット＃5を使用して、脳表面からの硬膜を除去します。硬膜を除去開始するサイトを選択するときには、大血管に隣接する領域を避けてください。出血が発生した場合は、ACSFのドロップを適用し、停止するために少量の出血のために2〜3分間待ちます。
11. ）低融点アガロースはACSFに溶解し、0.07パーセントの準備を体温に溶かしたアガロースを持参してください。脳の表面からACSFの過剰を拭き取ってください。ウィンドウにアガロースを注ぎ、スライドガラスでカバーしています。ガラスとヘッドプレートとの間の接触を作るために穏やかにガラスを押して、アガロースが固体になるまで10〜20秒待ちます。
12. ピンセットとソフトティッシュペーパーを用いてガラスカバーから過剰なアガロースを削除します。
13. 小を置くヘッドプレートにガラス周りの急激な接着剤の量は接着剤のガラス。接着剤（図1）を固めるための歯科用セメントの少量を適用します。

3。静脈注射と血液酸素化のモニタリング

注：私達は定期的にテキサスレッドの静脈内のアプリケーションの大腿静脈ではなく、尾静脈を使用していました。大腿静脈注射は、染料の安全性と再現性のボーラス注入を提供するためです。

1. 左腿の内側を露出させる部分的に上に動物を入れてください。この位置に動物を保護するためにテープを使用してください。
2. 消毒剤スクラブを適用した後、皮膚に100％エタノール。
3. 膝から恥骨結合の大腿内側に沿って切開を行います。ピンセット＃5を使用して、鈍的切開によって独立した軟組織。
4. テキサスレッド（2.5 mg / ml）を130μlで1ミリリットルシリンジを記入してください。新しい針（ゲージ30）を取り付け、ベベルを維持し、30℃で慎重に曲げます。針wiを埋める目のテキサスレッド·ソリューションを提供します。
5. 解剖顕微鏡下で、大腿静脈に針を挿入し、テキサスレッドの100μlを注入します。針を外し、軽く出血を止めるためにガーゼで静脈を押してください。
6. 4から0縫合糸を使用して、皮膚を​​閉じます。
7. 血液SPO ₂の連続監視（十分な血液の酸素化を確保するために）右大腿（そこから毛が以前に削除されました）にオキシメータプローブを配置します。

4。二光子イメージング

注：励起源としてsaレーザー：我々は、スペクトラ·フィジックスマイタイHP DeepSeeのフェムト秒TiオリンパスFluoview1000多光子イメージングシステム（直立）を使用します。イメージングのために、我々は、×10、NA 0.45（ツァイスC-アポクロマート）、または×25、NA 1.05（オリンパスXLPlan N）、水浸対物を使用しています。我々は、512×768ピクセルと512ピクセルが2μsの滞留時間で12ビットの深さで画像を取る。 NADH及びテキサスレッドデキストランは、同時に740 nmで励起され、フッ素れダイクロイックミラー（505DCXRU、クロマキーを使用して2つのチャネルに分割。escenceは、ダイクロイックミラー/近赤外ブロッキングフィルタの組み合わせ（FF01-680/SP、Semrock、ロチェスター、ニューヨーク、アメリカ合衆国FF665-DI01）を使用して、励起光から分離されている、ロッキンガム、バーモント州、米国）、バンドパスフィルタ（NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36）。目的は、層内にイメージングのためのIとII層におけるイメージングのための20から50 mWで10から20 mWであった後、レーザパワーを測定した。

1. 顕微鏡のステージに外科的に準備し、マウスを転送します。高倍率二光子血管造影での登録のための参照マップとして使用するために4倍の倍率での明視野照明を用いた頭蓋窓サイトの最初の写真を撮る。
2. ×10の倍率を使用して、関心領域に拡大します。皮質層IまたはII（軟膜表面下最大150μm）での関心の領域を選択します。高倍率が必要な場合は、×25の目標を使用
3. （ふぃぎゅ時系列を記録し始める再2）。我々は、画像の品質を高めるために3から5フレームの平均を使用することをお勧めします。
4. 動物が呼吸している空気に50％のN2を追加することによって、低酸素血症を誘発する。これは、10％O2レベルをもたらすでしょう。オキシメータのデータを監視することによって、低酸素血症を確認します。
5. 低酸素血症（例えば、30秒間）を介して時系列を記録し続け、通常の酸素レベルが復元された後。
6. 血管周囲の低酸素症および酸素組織シリンダーの面積を測定し、定量、検出することにより、酸素分布の計算のためのデータを収集します。

5。データ処理

1. クローグ組織円筒半径Rこれは、血管の中心と高いNADHの​​蛍光が検出される境界間の距離を測定することによって（図3）手動で行うことができますを決定します。
2. また、組織円筒半径Rの計算の研究者に依存しない半自動決定し、中央BLOを使う補足の形で以前に^1を説明し、このプロトコルのディスカッションセクションで要約されたOD容器R。
3. オープンアクセスの画像解析ソフトウェアは、例えばImageJを用いた低酸素領域を決定します。これを行うには、NADH信号を使用して、昇格したNADH組織の蛍光で面積を測定し、高いNADH強度領域の輪郭を描くしきい値を定義します。

6。代表的な結果

図2は、一時的な低酸素血症（この図のPDF版のために、選択した静止画像が使用されている）の間にNADH /血管造影画像のビデオを表示します。吸入酸素濃度は3分の期間の21％から10％に低下した。実験的低酸素血症のこのレベルでは、大脳皮質に重度の低酸素血症を誘導するのに十分である。低酸素症は、動脈の血液供給から遠いした地域で最初に、NADH蛍光の増加につながった。シャープNADH組織に注意してください。皮質の微小循環から酸素拡散の観察組織の境界を表す境界。 図3の画像は、脳血管周囲の酸素拡散境界のジオメトリを示します。以前に^1を説明したように、それは、これらの境界からシリンダ径クローグ推測することが可能です。

図1（）イメージングのために準備頭蓋ウィンドウでマウスをクリックします。 （B）ヘッドプレートの寸法。

図2内因性NADH緑色の蛍光が軟膜表面下約50μm、頭蓋窓を介して2つの光子イメージングで可視化。血管がテキサスレッドデキストランを用いて可視化である。吸入空気中の酸素が3分間10％に減少し、21％を復元されました。スケールバー：50μmの。

図3 NADH蛍光の境界のジオメトリを指定します。黄色のアウトラインは、機能的な低酸素状態の境界を示しています。青色の円は、投影酸素（クロー）シリンダを示しています。青い線は円柱の半径を示し、数字はマイクロメートルの半径を示しています。

酸素拡散について、高空間分解能の情報が脳内の血流が脳細胞に酸素を提供するために、代謝需要を満たすために規制されている方法を理解することが重要です。クラーク·スタイルのガラス電極を用いた従来のポーラログラフ酸素の測定は非常に侵襲的であり、低空間分解能^2-3と有意（秒の範囲）応答時間を持っています。これまでの脳組織のPO _2を測定するための唯一の非侵襲的な方法は、励起されたプローブの減衰率は酸素濃度が⁴に比例する燐光消光です。このメソッドは、正確な酸素濃度を提供していますが、独自の染料及び技術的に洗練された燐光寿命イメージングシステムが必要です。ここで、我々は2つ​​のflurescenceチャネルが標準で2光子イメージングシステム上で行うことができる簡単な、単純なアプローチを示しています。我々のアプローチは、本質的な組織信号⁵を活用してndは唯一の皮質微小循環の対照的な可視化を必要とします。ので、機能的に酸素濃度^1を 、制限するでNADH蛍光の非線型、本質的にバイナリの増加の本質的なNADH蛍光は重要な、代謝的に制限する低酸素症の領域でのみ観察された増加した。重要な含意は皮質の血管から酸素拡散の組織の境界を直接内因性のNADH蛍光の円筒状の強度変化が観測されるということです。血管周囲の組織の酸素化ボリュームを定義する円筒状構造の概念は、8月クローグによって導入され、最近では実験的に二光子NADH画像^1を使用^して観察されているので、我々は、クローグシリンダとして、これらの構造体を参照してください。クローグシリンダーの画像は、画像フレームのZ-スタックをとることにより、3Dで収集することができます。彼らは、貫通動脈の近傍で特に顕著であり、彼らは合同のウィットです。hは枯渇動脈周囲組織のシリンダ^1,4キャピラリー。

クローグ組織円筒半径Rの客観的な判断を（セクション5.2を参照）を提供するために我々は、円筒の中心とMatlabの関数"improfile"を使用して、外側の境界の間に、明確に定義されたセグメント内で、その半径方向のピクセルの強度値を測定した。セグメントの外側の境界は目に見える境界を越えて安全マージンを拡張するために選択する必要があります。信号対雑音レベルを向上させるために我々は、1°ステップで目に見える円筒セグメントをカバーするために必要なすべての放射状のライン上のaverageed。セグメント内の結果の平均半径方向の強度プロファイルが表示され、組織の境界Rに対応した急な増加を示した。我々は平均ラジアル強度プロファイルにシグモイド関数（例えばボルツマン関数）をフィットし、Rの定義として、その変曲点（これもX ₀として知られている）を使用しました。対応する2-Photon微小血管（テキサスレッド）シリンダの中心で孤独な中心的な血管の断面を明らかにした。中央の血管の直径は、直接rを決定するために適用することができます。

二光子NADHイメージングは​​、皮質の微小血管の同時高分解能イメージングと同じ空間分解能を提供しています。このメソッドの定量的なアプリケーションのための重要な特徴は、±NADH蛍光増加のP _50は 3.4であることが測定されていることである0.6ミリメートルHgの¹とmicroregional組織はpO ₂の関数としてのNADH蛍光強度は、数学で記述することができますシグモイド関数。 。我々は、この手法は一酸素（10％空気中の酸素含有量を減少させることによって）、最も脆弱な脳の領域を識別することができますことを示している。また、酸素の拡散は、単純な幾何学的な血管のパターンに従っていることを示しています。

OneクリティカルこのメソッドのiCalのステップでは、頭蓋窓の準備の質である。手術は、露出領域への血流を妨げないために、最小限の損傷を生成する必要があります。懸念は、外科的に妥協の準備では、ウィンドウの下にある皮質は、任意の有意義な実験を排除し、始まるために低酸素のかもしれないということです。よく準備された頭蓋のウィンドウには、すべての船種で鮮やかな血流との縁に沿って有意な出血をそのままメジャーとマイナーの血管を持っている必要があります。正常酸素状態（動脈血80から100 mmHgで、SpはO2 97から99パーセント）の下で、脳実質が上昇NADH蛍光の顕著な、明るい組織パッチのない均一な、均質なNADHの​​蛍光を示すべきである。

我々のアプローチの基本的な物理的制約は、深さの浸透を制限されています。脳内の青緑色NADH蛍光は、これらの波長でのヘモグロビンの吸収と組織の散乱によって急速に減衰します。さらに、高開口数（例えば1.05）を水で浸漬の目的は、二光子NADHイメージングは​​、現在、皮質の層IおよびIIに制限されています。白質に近接またはエネルギー代謝可能性が高い灰白質とは異なりますので、この制限は科学的に関連しています。生体⁶のマウス皮質で説明したようにしかし、このような層IV-VIまたはそのような白質路や線条体など皮質下構造の深皮質構造の調査は、特殊なレンズを使用する必要がある。

このような機能充血、キャピラリ流量率の検出⁷の分析など他の測定と組み合わせた場合の酸素拡散境界のNADHベースの測定は、特に役立ちます。たとえば、この技術は、脳卒中やアルツハイマー病（AD）モデルでは低酸素状態を可視化するために適応させることができます。酸素拡散の単純なジオメトリは1つが毛細血管密度が事実である状況下で微小血管床における酸素勾配を予測することができます。^8（例えば、AD ^9）しわの減少毛細血管密度と脳組織領域がmicrostrokesに起因する低酸素損傷のリスクがあるかどうかを検討する。イメージへの能力はmicroregionallyまた、1つは、組織microstrokesの形状とサイズを検証し、低酸素症が発生した組織のボリュームと同様に、組織低酸素症とその後の神経細胞死またはキャピラリーリフォーム¹⁰の間の関係を決定することができます。

内在性NADH蛍光の増加が急性ミトコンドリア機能障害の直接的な結果であるので最後に、このメソッドは神経エネルギー代謝¹¹とミトコンドリア機能障害のためのプロキシの特定のレポーターとしてNADHのイメージングを使用する機会を作成します。

結論としては、内因性のNADH蛍光の2光子イメージングは​​両方正常で、脳内の酸素供給と消費を理解するために使用することができ、シンプルで多くを求めないツールです。および病理学的状態にあります。

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、ヘッドプレート設計のための博士Maiken Nedergaard（ロチェスター大学医療センター）に感謝。作業はSDへのNIH賞（R01DA026325とP30AI078498とKK（DANAの基礎脳とImmunoimagingプログラムは、米国心臓協会0635595TとALS協会[＃1112）]に財団の補助金）によってサポートされています。