Vorremmo ringraziare Mark Lucanic e Hwai-Jong Cheng aiuto per acquisire le immagini a basso ingrandimento di intere fette di ippocampo presentati in questo video. Vorremmo anche ringraziare Sarah Parrish per aver aiutato con il testo che accompagna il video.

PROTOCOLLO per la trasfezione BIOLISTIC Nella produzione di proiettili Proiettili sono buoni per un massimo di 6 mesi, ma potrebbe cominciare a diminuire in termini di efficienza di trasfezione dopo 2-3 mesi. Proiettili deve essere conservato a 4 ° C in presenza di pellet essiccante. Sempre lasciato le fiale di scintillazione, in cui sono memorizzati proiettili, a temperatura ambiente prima di aprire il flacone. Prima di iniziare sono pronti: <ul><li> Spermidina (0,05 m) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100% di alta qualità, non aperto bottiglia) </li><li> Autoclavato H 2 0 </li><li> Di DNA da transfettate </li><li> Polivinilpirrolidone (PVP-20 mg / ml di brodo) </li><li> 2 x 15 ml coniche (2/bullet set) </li><li> Tubi (tagliato in 1 X ~ 30 pollici / set proiettile) </li><li> Fiale di scintillazione (set 1/bullet) </li><li> Essiccazione pellet </li><li> Siringa da 10 ml w / tubazioni alla fine </li></ul> Preparare tubi: <ol><li> Secco ~ 30 pollici di tubo (circa 2 pollici si estende oltre a destra O-ring) nella stazione di tubo w / N 2 gas (0,4 pressione) per un minimo di 20 min. </li></ol> Precipitare il DNA perline d&#39;oro: <ol><li> Preparare DNA da transfettate in 50 volumi μmL totale in provetta (massimo DNA 50 mg in totale) </li><li> Pesare 6-8 mg di oro e di trasferimento in un tubo da microcentrifuga </li><li> Aggiungere 100 ml di spermidina 0,05 m a oro e ultrasuoni per 20 secondi </li><li> Aggiungere i 50 ml di DNA per l&#39;oro / spermidine </li><li> Vortex (circa impostazione 5) w / cappello aperto </li><li> Aggiungere goccia a goccia 100 l di CaCl 2 1M </li><li> Sonicare brevemente (&lt;5 sec) </li><li> Lasciar decantare per 10 minuti a temperatura ambiente </li><li> Sonicare brevemente </li></ol> Preparare la soluzione PVP durante la sonicazione: <ol><li> Fai la soluzione diluita di PVP in 15 ml, 3,5 ml diluire PVP per ogni set di proiettili (aggiungere 7,5 l di magazzino 20mg/ml PVP al 3,5 ml di EtOH 100%) </li></ol> Risciacquo perline oro con EtOH: <ol><li> Spin down perle d&#39;oro alla massima velocità per 10 secondi in microcentrifuga </li><li> Gettare il surnatante, ma tenere una piccola quantità di liquido sulla parte superiore di perline oro </li><li> Lavare 3 volte con 1 ml di EtOH, ultrasuoni per un breve istante, se necessario </li></ol> Risospendere oro / DNA in soluzione PVP: <ol><li> Risospendere il pellet oro in 200 ml di ml 3,5 diluire PVP / EtOH soluzione </li><li> Vortex il pellet oro per sospendere di nuovo (brevemente sonicare se necessario) </li><li> Trasferire i 200 ml di oro / PVP soluzione ad un nuovo 15 ml conica </li><li> Continuare in questo modo, aggiungendo 200 ml di PVP alla volta fino a tutto l&#39;oro è stato trasferito il 15 ml conica, e il volume finale è di 3,2 ml </li></ol> Rivestimento tubi: <ol><li> Spegnere N 2 alla stazione di tubi e rimuovere tubi secca </li><li> Collegare il tubo secca alla siringa da 10 ml </li><li> Agitare vigorosamente i 15 ml conica riempita d&#39;oro / PVP </li><li> Posizionare l&#39;estremità del tubo in oro / soluzione di PVP e succhiare lentamente, facendo attenzione ad evitare le bolle </li><li> Lascia ~ 2 pollici a secco da entrambe le estremità del tubo </li><li> Con il tubo ancora attaccato alla siringa e riempite con la soluzione d&#39;oro / PVP, posizionare con attenzione il retro tubo nella stazione </li><li> Segnare le estremità del tubo in cui la soluzione si trova </li><li> Lasciate che l&#39;oro accontentarsi di 5 minuti con la siringa collegata </li><li> Succhiare-la soluzione molto lentamente tirando la siringa in modo che l&#39;oro si stabilirono è lasciato alle spalle (non sono sicuro di fare back-wash) </li><li> Staccare la siringa </li><li> Ruota di 90 ° e lasciate riposare 2 secondi </li><li> Ruotare di 180 ° e lasciate riposare altri 2 secondi </li><li> Ruotare la provetta per 5 sec </li><li> Accendere la N 2 in modo che la valvola si legge tra 0,4 - 0,5 e girare l&#39;oro rivestite tubi durante l&#39;asciugatura per 5 min. </li></ol> Taglio tubi: <ol><li> Rimuovere il tubo dal tubo preparazione-stazione e tagliare le estremità a marchi. </li><li> Metti una fiala di scintillazione etichettati con l&#39;elicottero tubi per prendere le cartucce taglio </li><li> Tubo posto nel tubo di chopper e tagliare il tubo con il rasoio pulito </li><li> Posizionare un pellet essiccazione in flaconcino scintillazione </li><li> Conservare le cartucce a 4 ° C </li></ol> Shooting fette di tessuto Quando si riprende fette colto, è importante utilizzare una tecnica relativamente sterile per evitare contaminazioni. Ricordate che quando si scatta due costrutti differenti, entrambe le serie di proiettili che possono essere caricati nel supporto della cartuccia stessa, ma la canna-liner e lo schermo dovrebbe essere cambiato tra i costrutti. Prima di iniziare sono pronti: <ul><li> Proiettili del DNA (per non fiala di scintillazione a temperatura ambiente prima di aprire) </li><li> Fette di tessuto </li><li> Helios Gun Gene </li><li> Serbatoio di elio con tubo gene pistola allegato &lt;/ Li&gt; <li> Cartuccia titolare </li><li> Botte con fodera in plastica O-ring in posizione </li><li> Diffusore (modificato) </li><li> Diffusore schermo </li><li> Forcipe </li></ul> Preparando la pistola gene: <ol><li> Forcipe utilizzando posto delle cartucce di plastica rivestiti in oro il supporto della cartuccia. </li><li> Posizionare il supporto della cartuccia nella pistola gene dapprima spingendo indietro blocco </li><li> Fissare il supporto della cartuccia con serratura </li><li> Ottenere un rivestimento a botte con un O-ring e lo schermo diffusore saldamente in posizione </li><li> Avvitare la canna-liner nella pistola gene </li></ol> Shooting fette di coltura con la pistola del gene: <ol><li> Indossare cuffie </li><li> Collegare la pistola gene in tubo collegato serbatoio del gas elio </li><li> Alzare la pressione sul serbatoio a 180 PSI </li><li> Spara un vuoto in aria al fine di rimuovere ogni traccia di polvere o detriti dallo schermo diffusore. Per sparare la pistola, prima premere il pulsante di blocco di sicurezza fino a quando il bip pistola, poi premere il grilletto. </li><li> Dopo lo scatto in bianco, togliere le fette dalla incubatore </li><li> Anticipo pistola a costruire prima </li><li> Spara con lo schermo diffusore di circa 0,5 - 1 pollice dalla fetta </li><li> Anticipo la cartuccia tra i pozzi. </li><li> Dopo aver sparato il bene ultimo, disporre le fette di nuovo nel incubatore </li><li> Spegnere la pressione del gas e rilasciare prima di staccare la pistola dal tubo di elio </li><li> Svitare il rivestimento barile, e rimuovere la cartuccia e le conchiglie utilizzate </li></ol> Pulizia titolari cartuccia e rivestimenti barile: <ol><li> Cartucce luogo, rivestimenti barile, e gli schermi diffusore in un bicchiere con acqua e sapone </li><li> Bicchiere posto in bagno sonicatore e ultrasuoni per 20 minuti </li><li> Sciacquare con acqua fino a quando tutti i residui di sapone vengono rimossi </li><li> Mettere a bagno in 70% EtOH per un&#39;ora </li><li> Mettere su carta assorbente per asciugare asciugare durante la notte </li><li> Pulire le cartucce, rivestimenti barile, e gli schermi possono essere riutilizzati nei successivi trasfezioni biolistic </li></ol> Riprese suggerimenti guai per Transfection Biolistic Trasfezione Biolistic a volte può risultare in condizioni non ottimali di trasfezione. Può portare a troppo pochi o troppo molte cellule transfettate, troppo alti o troppo bassi livelli di espressione, o può causare fette di tessuto a diventare generalmente malsano. Spesso il risultato malsano fette dall&#39;esplosione di pressione. Ecco alcuni consigli per ottenere fette di tessuto in modo ottimale transfettate. Se le fette sembrano essere malsana (o se troppe cellule sono transfettate / fetta), prova: <ul><li> all&#39;aumentare della distanza di tiro </li><li> diminuzione di pressione sul serbatoio del gas </li><li> diminuendo la quantità di oro </li><li> tagliare fuori il centro della Bio-Rad diffusore e sostituire il centro con uno schermo diffusore. </li></ul> Se le cellule sono troppo pochi transfettate, prova: <ul><li> diminuzione distanza di ripresa </li><li> crescente pressione sul serbatoio del gas </li><li> aumentare la quantità di oro </li><li> aumentando il numero di fette di tessuto / e </li><li> assicurarsi che l&#39;O-ring nella canna-liner è intatto. </li></ul> Se si ottengono fette con entrambe le celle troppi e troppo pochi transfettate durante le riprese stesse accertarsi che: <ul><li> che si sta tenendo la pistola simmetricamente sopra e </li><li> che l&#39;oro è uniforme rivestimento all&#39;interno del tubo. (Se hai trovato una linea d&#39;oro, tirare fuori il surnatante dal tubo ad una velocità maggiore una volta che l&#39;oro si è stabilito e ruotare l&#39;oro più a lungo prima di accendere l&#39;azoto. Se, invece, hai trovato striature d&#39;oro , questo è probabilmente dovuto all&#39;esposizione troppa umidità durante rendendo proiettile: assicurarsi che si sta utilizzando una bottiglia chiusa di EtOH, che il tubo sia completamente asciutto prima di rivestimento, e che si tappatura coperchi e la preparazione di proiettili in un modo attuale). </li></ul> Se l&#39;efficienza di trasfezione sembra ottimale (# cellule transfettate / fetta), ma il livello di espressione sembra troppo alta o troppo bassa: <ul><li> regolare il rapporto di DNA in oro. (Ad esempio, se è troppo basso mantenere la quantità di oro, ma aumentare la quantità di DNA.) </li><li> regolare la quantità di tempo tra le riprese e la raccolta dati </li></ul> Nel caso di transfezione doppio, se hai trovato espressione troppo poco di uno dei tuoi costrutti, regolare il rapporto tra i due costrutti in modo appropriato e fare in modo che entrambi i costrutti sono sotto il promotore stesso, in modo da assicurarsi che uno promotore non entrare in competizione l&#39;altro.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Transfezione Biolistic è un mezzo fisico di trasfezione delle cellule tramite bombardamento di tessuto vivente ad alta velocità con particelle d&#39;oro rivestiti di DNA. Nel trasferimento di geni mediato delle particelle, in genere cellule transfettate risultato quando il proiettile si ferma nel nucleo. Mentre molti metodi di trasfezione diverse esistono, come la microiniezione, lipofection, calcio-fosfato trasfezione, elettroporazione e trasfezione virale, trasfezione biolistic in grado di offrire un lavoro meno intenso, ed efficiente alternativa per trasfezione delle cellule che non sono facilmente transfettate con questi altri metodi. Infatti, è stato sviluppato come una tecnica di trasferimento genico nelle piante in quanto la presenza della parete cellulare reso difficile trasfezione con metodi preesistenti 1. Allo stesso modo, biolistics ha guadagnato popolarità nel campo della neurobiologia dall&#39;ultimo post-mitotico neuroni sono notoriamente difficili da 2,3 trasfezione. In particolare, è ampiamente riconosciuto come la tecnica del principio da utilizzare in esperimenti volti a valutare la morfologia multa di singoli neuroni in fettine di cervello intatto. I metodi descritti qui fornisce una spiegazione dettagliata e completa di come eseguire trasfezione biolistic di fette di cervello colto con una mano tesa gene-gun (Gun sistema Helios Gene; Bio-Rad). Trasfezione Biolistic è diventato il metodo preferito per la trasfezione neuroni in cultura fetta perché permette trasfezione di un certo numero di cellule sparse per tutta la fetta cervello. In questo modo, i singoli neuroni possono essere esaminate in modo isolato. Poiché questa tecnica è particolarmente adatto per trasfezione neuroni nel cervello fetta, è spesso utilizzato in combinazione con 2-fotone microscopia, dal momento che 2-fotone eccitazione permette la visualizzazione di cellule marcate in profondità all&#39;interno dei tessuti dispersione della luce 4. Infatti le immagini ad alto ingrandimento dei singoli neuroni piramidali presentato in tutto il video sono stati catturati usando un custom 2-fotone microscopio a scansione laser. In conclusione la transfezione biolistic è un mezzo efficace di trasfezione delle singole cellule nel contesto di una alta densità di cellule circostanti, e come tale si è dimostrato estremamente utile per l&#39;etichettatura fluorescente singoli neuroni in coltura fetta neuronale.

Anche se abbiamo elencato tutti i prodotti separatamente, è più economico per l&#39;acquisto di &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, che include tutti i prodotti da Bio-Rad sopra elencati (cat # 165-2431).

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

Transfezione Biolistic è un mezzo fisico di trasfezione delle cellule dei tessuti bombardando con particelle ad alta velocità DNA rivestito. Forniamo un protocollo dettagliato per la trasfezione biolistic fettine di ippocampo di ratto, dalla preparazione iniziale dei proiettili rivestiti di DNA per le riprese finali delle culture fetta organotipica utilizzando una pistola genica. Pistola transfezione gene è un mezzo efficace e facile trasfezione di neuroni ed è particolarmente utile per l&#39;etichettatura fluorescente un piccolo sottoinsieme di cellule fetta del tessuto. In questo video, ci siamo delineare i passaggi necessari per rivestire le particelle d&#39;oro con il DNA. Siamo prossimi alla linea di dimostrare come l&#39;interno del tubo di plastica con i proiettili d&#39;oro / DNA, ed a tagliare questo tubo per ottenere le cartucce di plastica per il caricamento nella pistola gene. Infine, eseguiamo trasfezione biolistic di culture fetta dell&#39;ippocampo di ratto, dimostrando la gestione della Bio-Rad Helios pistola del gene, e offrendo consulenza riprese briga di ottenere fette di tessuto sano e ottimale transfettate.

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Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Descriviamo un metodo per la preparazione di proiettili rivestiti d&#39;oro del DNA e dimostrare l&#39;uso di proiettili ad esempio per trasfettare biolistically neuroni in colture di fettine di ippocampo.

Preparazione di proiettili pistola Gene e Biolistic Transfection dei neuroni in cultura Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

52.3K Views.  University of California, Davis. Descriviamo un metodo per la preparazione di proiettili rivestiti d'oro del DNA e dimostrare l'uso di proiettili ad esempio per trasfettare biolistically neuroni in colture di fettine di ippocampo.

Video: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Slice preparazione orizzontale della Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Ricerca

Biologia

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Hi, I'm Kma. I work in Case Lab at Brown University Clean Slicer stage with 70%ethanol. Place plate insert into six.Well plate with medium and incubate at 37 degree whole brain with tweezers between midbrain and four brainin. Isolate hippocampus on one side, isolate hippocampus from the second side. Place hippocampi onto A PBS drop.Aspirate out the PBS make sagittal sections using the tissue slicer. Repeat transfer slicers onto a perish by squatting with PBS wash sections by adding and aspirating PBS and medium gently. Separate sections with tweezers.Wash sections with PBS and media. Again, transfer sections onto the plate and insert. Aspirate out the media in sections using tweezers.Attach gene gun hose to the helium cylinder. Attach barrel to gene gun. Fill the magazine with bullets.Insert magazine into the Jing gun. Adjust the pressure on the helium tank shoot. EGFP coated beads onto the sections.And now.

Gene-gun trasfezione di neuroni dell&#39;ippocampo

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Preparazione e manutenzione dei neuroni dei gangli dorsali in Culture Compartmented

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induzione e test di ipossia in coltura cellulare

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

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