La maggior parte delle condizioni di salute può essere gestita meglio se rilevata precocemente. I biomarcatori disponibili nei fluidi corporei accessibili sono i modi più promettenti per la diagnosi precoce delle condizioni di salute. Stiamo riportando miglioramenti nei metodi di studio dei biomarcatori di microRNA rilasciati attraverso piccole vescicole extracellulari dal cervello umano.
Questo metodo ci ha permesso di identificare la variazione nei piccoli carichi vescicali extracellulari tra diversi sottotipi genetici di malattia, come la demenza, di identificare i candidati biomarcatori del carico che potrebbero essere rilevati nei fluidi periferici e di migliorare la diagnosi precoce della malattia. In questo modo questo protocollo bilancia l'efficienza, l'accessibilità e la purezza del prodotto, rendendolo facilmente riproducibile in diversi ambienti di laboratorio. Non richiede alcuna attrezzatura specializzata e le colonne preconfezionate garantiscono la coerenza.
Pertanto, qualsiasi risultato di biomarcatore sarà facilmente tradotto in un risultato clinico desiderato. Con l'approvazione di nuovi farmaci modificanti la malattia, la diagnosi deve essere effettuata molto prima di quanto attualmente possibile per massimizzare i benefici per il paziente. Metodi come questo porteranno all'identificazione di nuovi biomarcatori di microRNA rilevanti per la malattia, che possono portare a una migliore gestione della salute utilizzando opzioni di trattamento e cura specifiche.
Utilizzeremo le nostre capacità esistenti per sviluppare metodi per identificare marcatori specifici per tipo di tessuto e cellula in grado di rilevare biomarcatori di microRNA rilasciati da un tipo di cellula specifico all'interno di una miscela eterogenea presente nei fluidi corporei. Per iniziare, affettare sottilmente 250 milligrammi di tessuto cerebrale congelato usando un bisturi sterilizzato su una piastra fredda. Aggiungere al tessuto due millilitri di 75 unità per millilitro di collagenasi di tipo III in soluzione ibernata.
Mettere ogni campione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Al segno dei cinque minuti, capovolgere il campione due volte per mescolare. Al termine dei 10 minuti, pipettare delicatamente il campione tre volte utilizzando una stripette monouso in plastica da 10 millilitri.
Quindi posizionare ogni campione sul ghiaccio e aggiungere il cocktail di inibitori della proteasi e l'inibitore della fosfatasi a ciascun campione. Centrifugare ogni campione di tessuto cerebrale a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogli il surnatante.
E poi centrifugarlo a 2000G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. A questo punto raccogli il surnatante e filtralo attraverso un filtro da 0,22 micrometri. Quindi centrifugare il filtrato a 10.000 G per 48 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver raccolto il surnatante, aggiungere un tampone di precipitazione a ciascun campione in un rapporto di due a uno. E incubare il campione per una notte a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare ogni campione a 10.000 G per 96 minuti a quattro gradi Celsius.
E risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS privo di vescicole extracellulari. Equilibrare la cromatografia ad esclusione dimensionale o la colonna SEC pre-preparata a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'equilibratura, rimuovere il tampone conservante dalla parte superiore della colonna e lavare la colonna due volte utilizzando 250 microlitri di PBS privo di vescicole extracellulari.
Quindi aggiungere il pellet risospeso alla colonna e centrifugare a 50G per 30 secondi. Dopo aver scartato il flusso, aggiungere 180 microlitri di PBS senza EV e centrifugare la colonna a 50 G per un minuto per consentire l'eluizione delle piccole vescicole extracellulari derivate dal cervello. Per eliminare le piccole vescicole extracellulari, diluire il campione di piccola vescicola extracellulare isolato in un rapporto uguale con il tampone di lisi e di estrazione.
Agitare il campione diluito a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Quindi centrifugare il campione a 14.000 G per 15 minuti. Raccogli il surnatante proteico e misura le concentrazioni proteiche utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine.
Per eseguire l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, diluire ciascun campione in PBS utilizzando un fattore di diluizione da 1 a 1000. Iniettare il campione nello strumento NTA. E impostare lo strumento per leggere il campione a una lunghezza d'onda di 550 nanometri.
Utilizzare la quantità di particelle per misurare la quantità di proteine per particella espressa in femtogrammi secondo le linee guida MISEV. Quindi, diluire l'arancione della maschera cellulare o il colorante CMO in PBS con un fattore di diluizione da 1 a 1000. Quindi diluire il colorante CMO con il piccolo campione di vescicola extracellulare utilizzando un fattore di diluizione da 1 a 10.
E incubare la miscela al buio per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Ora, diluire ulteriormente la miscela di piccole vescicole extracellulari del colorante CMO utilizzando PBS con un fattore di diluizione da 1 a 1000. Utilizzando lo strumento NTA, leggere il colorante CMO di ogni piccolo campione di vescicola extracellulare a una lunghezza d'onda di 550 nanometri.
Per il tracciamento degli anticorpi fluorescenti, diluire ciascun tetraspan e anticorpo fluorescente in PBS utilizzando un fattore di diluizione da 1 a 10. Quindi diluire ciascun colorante anticorpale con il piccolo campione di vescicola extracellulare utilizzando un fattore di diluizione da 1 a 10. E incubare la miscela al buio per due ore a quattro gradi Celsius.
Successivamente, diluire la seconda miscela di anticorpi utilizzando PBS con un fattore di diluizione da 1 a 1000. Leggere i segnali anticorpali fluorescenti del piccolo campione di vescicola extracellulare a una lunghezza d'onda di 550 nanometri utilizzando lo strumento NTA. L'analisi Western blot ha confermato la presenza dei marcatori positivi CD9, CD63, CD81, Flotilla One e TSG101 nelle piccole vescicole extracellulari derivate dal cervello, mentre la calnexina era assente indicando l'assenza di contaminazione cellulare.
L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle ha rivelato che le particelle isolate avevano una dimensione compresa tra 50 e 200 nanometri, con una concentrazione di picco di circa 100 nanometri. I dati di colorazione CMO hanno mostrato che il 52,35% delle particelle ha un doppio strato lipidico, di cui il 34,66% conteneva CD9, il 15,49% conteneva CD63 e il 12,01% conteneva CD81.
