Questo studio ha introdotto una manipolazione chirurgica per esporre il DRG toracico in topi anestetizzati per l'imaging del calcio in vivo insieme alla registrazione sincronizzata dell'elettrocardiogramma. In questo modo, cerchiamo di rispondere se l'agopuntura al PC6 sul forame potrebbe attivare il neurone DRG e contemporaneamente regolare l'elettrocardiogramma. Le tecniche attualmente utilizzate negli studi di agopuntura includono l'elettrofisiologia in vivo o in vitro, il tracciamento neurale e varie strategie combinate con l'optogenetica e la chemiogenetica.
L'imaging del calcio in vivo introdotto in questo studio aiuta a comprendere meglio le attività delle popolazioni di neuroni DRG indotte dall'agopuntura, il tutto in diversi modelli animali, tramite registrazioni dinamiche e in tempo reale. A causa della fisiologica curvatura della colonna vertebrale toracica da uno a cinque segmenti vertebrali, i DRG toracici sono piuttosto difficili da esporre. Inoltre, le influenze dei ritmi cardiaci e polmonari rendono difficile la fissazione dei DRG toracici.
In caso contrario, l'anestesia respiratoria e il mantenimento delle condizioni dei topi per ore non sono facili. L'imaging del calcio in vivo rivela l'attività di specifiche popolazioni di neuroni utilizzando topi geneticamente modificati. Questa è la prima volta che i neuroni DRG toracici sono stati osservati in vivo.
Questo approccio realizza l'osservazione delle attività neuronali prodotte da stimolazioni somatiche o viscerali e la loro diafonia. Il nostro laboratorio ha stabilito metodi per l'imaging del calcio in vivo del DRG toracico e lombare e, in futuro, esamineremo i recettori relativi ai fattori iniziali dell'agopuntura, all'ipersensibilità degli accupunti, alle interazioni tra la stimolazione dell'agopuntura somatica e gli input viscerali. Dopo aver eseguito una tracheotomia su un topo anestetizzato, posizionare il mouse in posizione prona su un tappetino riscaldato.
Praticare un'incisione longitudinale di due centimetri al centro della nuca, estendendosi dalle sei vertebre cervicali alle tre vertebre toraciche. Separare accuratamente il grasso e le ghiandole ibernate nella parte anteriore delle vertebre toraciche del topo, evitando i vasi sanguigni sotto le ghiandole. Usa le forbici a molla per tagliare la pelle e gli strati muscolari, compreso il muscolo trapezio.
Inserire un divaricatore tra i muscoli per facilitare l'ulteriore esposizione. Rimuovere i muscoli che si attaccano al morsetto per la testa e la parte diritta dei muscoli lunghi del collo, esponendo i processi spinosi del secondo torace. Spostare i muscoli semispinali e spinali per esporre l'arco vertebrale da C6 a T3. Recidere la connessione tra la placca dell'arco vertebrale e il processo articolare di quella toracica.
Utilizzare una pinza fine per rimuovere meticolosamente i processi articolari sinistro e destro e i processi mammillari di quello toracico. Eliminare il tessuto connettivo sovrastante. Esporre con cura il ganglio della radice dorsale toracica sinistra o destra, o DRG, garantendo l'integrità dell'epinevrio sul lato scelto.
Posiziona un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina calda sopra il DRG esposto per mantenere l'umidità. Collegare il monitor ECG con il polo negativo sull'arto superiore destro, il filo di terra sull'arto inferiore destro e il polo positivo sull'arto inferiore sinistro. Posiziona il mouse sul palco del morsetto spinale personalizzato con un termoforo.
Fissare il mouse utilizzando due clip attaccate ai processi articolari del sei cervicale e del tre toracico. Posizionare la pinza spinale con il mouse fissato sotto il microscopio confocale. Posizionare l'obiettivo pneumatico a lunga distanza di lavoro 10x/0,32 sopra il DRG toracico 1 esposto.
Impostare la dimensione del passo su 25 micrometri e una risoluzione di 512 x 512 o 1, 024 x 1, 024 pixel (1, 024 x 1, 024 pixel). Regola l'asse z del tavolino su e giù e cattura l'intero DRG toracico 1. Applicare la stimolazione a pennello sull'arto superiore del topo e valutare la reattività dei neuroni DRG visualizzati.
Eseguire le stimolazioni dei nervi periferici alla stimolazione PC6 utilizzando uno stimolatore. In condizioni basali, la maggior parte dei neuroni nel DRG toracico 1 non mostrava fluorescenza GFP. La stimolazione somatica ha determinato un aumento rapido e transitorio della fluorescenza GCaMP con un aumento del numero e dell'intensità della GFP.
Le stimolazioni dei nervi periferici all'applicazione di PC6 hanno portato a cambiamenti nella fluorescenza GCaMP simili a quelli della stimolazione somatica. I neuroni sono stati contrassegnati e numerati all'interno di un singolo DRG toracico 1 dopo il tracciamento con il software di imaging. I neuroni che mostravano variazioni di intensità della fluorescenza superiori al 130% della soglia F0 sono stati considerati risposte positive.
L'istogramma mostrava i diversi diametri dei neuroni che rispondono alle stimolazioni dei nervi periferici a PC6. Le stimolazioni dei nervi periferici alla stimolazione PC6 hanno mostrato un aumento della frequenza cardiaca.
