Il mio gruppo di ricerca si concentra sulla biologia molecolare e la biochimica fondamentali delle linee di assemblaggio biosintetiche nei batteri. Il nostro obiettivo è quello di ingegnerizzare i batteri per produrre nuovi antibiotici. Siamo appassionati di portare questo lavoro in classe, fornendo agli studenti un'esperienza pratica nelle tecniche all'avanguardia della biotecnologia.
La clonazione a base di topoisomerasi è attualmente utilizzata nell'aula di biologia molecolare della Cal Poly per introdurre gli studenti alla clonazione molecolare. Gibson Assembly è emerso come una tecnica di clonazione molecolare rilevante a livello industriale e stiamo cercando di fornire agli studenti esperienze applicabili. La clonazione molecolare è una tecnica che può essere difficile da concettualizzare in una classe universitaria tradizionale.
Abbiamo progettato un modulo di laboratorio pratico in cui gli studenti progettano e valutano il loro esperimento, oltre a contribuire a veri e propri progetti di ricerca. Ciò migliora la loro comprensione del processo di clonazione e delle applicazioni del loro lavoro. Sebbene siano state pubblicate altre esperienze di ricerca universitaria basate su corsi che utilizzano tecniche di clonazione molecolare, nessuna include un modulo di assemblaggio Gibson adattabile.
Abbiamo progettato tutti i materiali per misurare i risultati dell'apprendimento per questa esperienza di ricerca universitaria basata su corsi. Speriamo che questo serva come strumento di educazione scientifica facilmente implementabile per migliorare la valutazione degli istruttori e la formazione degli studenti nei laboratori di biologia molecolare a livello universitario. Per iniziare, determina la fonte del modello di DNA per gli inserti genici, come il DNA genomico, il plasmide o il DNA sintetico.
Recupera le sequenze di DNA degli inserti genici e del vettore. Importare le sequenze di inserimento e le sequenze vettoriali desiderate in Benchling come nuovi file di sequenze di DNA. Quindi aprire ogni sequenza importata da utilizzare nella reazione di assemblaggio di Gibson.
Ora individua lo strumento Assembly Wizard nella parte inferiore dello schermo. Fare clic su Creazione guidata assemblaggio, quindi selezionare Crea nuovo assemblaggio. Dalle opzioni fornite, selezionate Gibson e fate clic su Avvia per iniziare l'assemblaggio.
Nella finestra Sequenza vettoriale, selezionare le basi della spina dorsale vettoriale a partire dall'estremità 3 prime dell'inserto genico fino all'estremità desiderata. Una volta selezionato, fai clic sulla scheda Backbone nella parte inferiore dello schermo e scegli Imposta frammento. Nella finestra Sequenza di inserimento, selezionare tutte le basi di inserimento da includere nell'assieme.
Una volta selezionato, fai clic sulla scheda Inserisci nella parte inferiore dello schermo e scegli Imposta frammento. Se sono presenti più inserti genici, fare clic sul pulsante più sul lato destro della procedura guidata di assemblaggio. Nella finestra Sequenza di inserimento, selezionare tutte le basi per l'inserto aggiuntivo da includere nell'assieme.
Una volta selezionato, fai clic sulla scheda Inserisci nella parte inferiore dello schermo e scegli Imposta frammento. Una volta impostati tutti i frammenti, rinominare l'assembly con il nome del plasmide desiderato. Fare clic su Assembla (Assemble) sul lato destro della Creazione guidata assemblaggio.
Quindi selezionare la posizione della cartella desiderata sia per la cartella della sequenza che per la cartella del primer e fare clic su Crea per assemblare la sequenza del plasmide ricombinante. Ora apri il plasmide assemblato e fai clic su Cronologia assemblaggio per visualizzare una mappa plasmidica di base e una panoramica delle sequenze da cui è stata derivata. Nella scheda Parametri assieme, visualizzare i nomi dei primer progettati per l'assieme.
Verificare che ci siano due primer per ogni inserto e che i nomi dei primer derivino dai titoli dei file di sequenza del DNA. Assicurarsi che le temperature di fusione dell'innesco e le temperature di ricottura suggerite siano compatibili. Una volta completata la progettazione del primer per i plasmidi desiderati, fare clic su Finalizza nella procedura guidata di assemblaggio.
Utilizzando un esperimento di PCR a gradiente con i modelli di DNA, testare sia le coppie di primer specifici dell'inserto che quelle del vettore per verificare che le temperature di ricottura siano ottimali. Una volta determinate le temperature di ricottura, creare aliquote di soluzioni di primer, modelli di DNA e reagenti necessari per le reazioni PCR per gli studenti. Per iniziare, ottenere primer e soluzioni di DNA stampo per la PCR dall'istruttore.
Utilizzando i reagenti mostrati qui, preparare reazioni PCR da 25 microlitri per ottenere frammenti lineari delle sequenze di DNA desiderate. Ciclo della reazione in un termociclatore. Assicurarsi che la temperatura di ricottura sia appropriata per gli inneschi e che il tempo di prolunga sia adatto alla lunghezza dell'amplicone desiderato.
Successivamente, analizza cinque microlitri di ciascuna reazione tramite elettroforesi su gel di agarosio. Mentre il gel è in funzione, aggiungere un microlitro di enzima di restrizione DpnI a ciascuna reazione che ha utilizzato il DNA plasmidico come modello. Incubare questa miscela per un'ora a 37 gradi Celsius.
Quindi eseguire l'imaging del gel per confermare che la PCR ha avuto successo e che è stata raggiunta l'amplificazione corretta. Purificare tutte le reazioni PCR riuscite utilizzando un kit di purificazione PCR disponibile in commercio. Misurare la concentrazione del prodotto PCR purificato utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi da utilizzare nei successivi calcoli di assemblaggio Gibson.
Pipettare i componenti della reazione dell'assemblaggio Gibson. Incubare la reazione a 50 gradi Celsius per 15 minuti. Mentre le reazioni incubano, scongelare le cellule di Escherichia coli chimicamente competenti sul ghiaccio per la trasformazione.
Trasforma due microlitri della reazione di assemblaggio di Gibson in celle chimicamente competenti tramite shock termico. Pipettare 100 microlitri delle cellule trasformate su due piastre di selezione e distribuire con perle sterilizzate. Incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, conservare il piatto a quattro gradi Celsius. Quindi conta le colonie su tutte le piastre e calcola l'efficienza della trasformazione utilizzando la formula data. Usando un pennarello, seleziona ed etichetta quattro colonie distinte sulla piastra di selezione con le iniziali dello studente e un numero.
Prendi una nuova piastra di agar LB contenente antibiotici per la selezione e dividila in quadranti. Usa circa metà di ogni colonia per riposare sul rispettivo quadrante. Aggiungere la corretta concentrazione di antibiotico alle provette etichettate con l'identità della colonia per la selezione.
Quindi inoculare una coltura LB liquida da cinque millilitri con l'altra metà di ciascuna delle quattro colonie selezionate. Incubare le colture liquide in un incubatore vibrante a 37 gradi Celsius per una notte e la piastra di agar in un incubatore statico alla stessa temperatura. Isolare il DNA plasmidico dalle colture liquide utilizzando un mini kit di preparazione.
Misurare la concentrazione del DNA plasmidico isolato in nanogrammi per microlitro. Dopo aver progettato uno screening PCR del digest di restrizione per analizzare i plasmidi isolati, pipettare le reazioni del digest di restrizione o le reazioni PCR. Quindi analizzare i risultati mediante elettroforesi su gel.
Una volta completato il modulo di assemblaggio Gibson, chiedi agli studenti partecipanti di completare il questionario a scelta multipla durante la riunione di laboratorio. Combina tutti i dati delle risposte al questionario prima e dopo l'analisi e valuta la loro significatività statistica. Dopo il progetto, il punteggio medio del contenuto è aumentato significativamente dal 63,7% all'80,4%, indicando una migliore comprensione da parte degli studenti dei concetti di biologia molecolare e clonazione.
La confidenza media a termine è aumentata significativamente da 3,52 a 3,87, con un'ampia dimensione dell'effetto che dimostra una migliore comprensione dei termini di biologia molecolare da parte degli studenti. La fiducia dello studente medio nell'esecuzione delle tecniche di laboratorio è aumentata significativamente da 3,82 a 4,33, mostrando una maggiore familiarità con le tecniche di biologia molecolare. Il numero di risposte che indicavano familiarità con il termine assemblaggio di Gibson è aumentato significativamente dal questionario pre a quello post, con un notevole aumento di coloro che potevano spiegare il termine.
La fiducia nell'esecuzione della tecnica di assemblaggio di Gibson è migliorata con la maggior parte delle risposte, passando da neutrale o in disaccordo prima della sessione a concordare o fortemente d'accordo dopo. La fiducia degli studenti negli argomenti di biologia generale non ha mostrato cambiamenti statisticamente significativi. Al contrario, la fiducia nelle questioni di assemblaggio Gibson specializzate è aumentata in modo significativo.
