L'ambito della nostra ricerca prevede lo sviluppo e la convalida di un metodo non invasivo per misurare il contenuto di carbonio nei macrofagi delle vie aeree come biomarcatore per l'esposizione al particolato contenente carbonio. Il nostro obiettivo è determinare l'accuratezza e l'affidabilità di questo metodo di valutazione dell'esposizione individuale su larga scala. Il nostro protocollo fornisce un metodo non invasivo, preciso e standardizzato per misurare il contenuto di carbonio nei macrofagi delle vie aeree.
Come biomarcatore dell'esposizione interna, si tratta di un'esposizione individuale efficace e accurata al particolato contenente carbonio. Il nostro protocollo offre un biomarcatore diretto e affidabile per l'esposizione individuale al particolato contenente carbonio. Questo metodo consente la quantificazione su larga scala utilizzando l'espettorato indotto, migliorando sia l'accuratezza che l'affidabilità rispetto ad altre tecniche.
Inizia raccogliendo un campione di espettorato da due millilitri in una provetta da centrifuga. Quindi, aggiungere da 20 a 30 millilitri della soluzione fissativa preparata al tubo e mescolare accuratamente il contenuto. Per preparare la soluzione digestiva per la sospensione cellulare, sciogliere 0,1 grammi di ditiotreitolo in 100 millilitri di soluzione fisiologica, secondo il dosaggio richiesto.
Ora, centrifugare la provetta contenente l'espettorato a 1.998 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, scartare il surnatante. Aggiungere un volume uguale di digestato di espettorato al precipitato.
Agitare e agitare bene il composto. Successivamente, posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino alla completa liquefazione. Quindi, filtrare la miscela liquefatta utilizzando una membrana filtrante da 70 micrometri.
Centrifugare la soluzione filtrata a 500 G per sette minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante, mantenendo la cellula precipitata. Ora, risospendere il precipitato cellulare nel tampone fosfato di Duchenne.
Centrifugare la soluzione a 500 G per sette minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un precipitato cellulare puro. Per la preparazione dello striscio cellulare, aggiungere da 200 a 600 microlitri di tampone fosfato al sedimento cellulare e mescolare accuratamente. Quindi, prelevare 20 microlitri di sospensione cellulare e creare uno striscio cellulare.
Fissare lo striscio essiccato con una soluzione colorante disponibile in commercio per 10 secondi. Successivamente, immergere lo striscio nella soluzione colorante A per otto secondi. Durante la colorazione, sollevare delicatamente il vetrino su e giù, quindi risciacquare la macchia in eccesso con acqua corrente.
All'interno delle celle sono stati osservati piccoli aggregati di particelle di black carbon distintamente visibili, che variavano nella quantità di particelle di carbonio. Per iniziare, visualizza i vetrini di espettorato colorati al microscopio. Seleziona casualmente macrofagi ben colorati e morfologicamente intatti e cattura le loro immagini.
Utilizzando il software ImageJ, è possibile misurare la scala per ottenere una conversione accurata dei pixel. Selezionare Misura e fare clic su Imposta scala. Inserisci la distanza in pixel, la lunghezza effettiva e l'unità di lunghezza, micrometri.
Quindi, seleziona l'opzione Globale. Ora, delinea le celle con una forma irregolare e rimuovi lo sfondo usando le selezioni a mano libera. In Modifica selezionare Cancella esterno.
Misura l'area totale delle celle tramite Analizza e Misura. Ritaglia il nucleo con Modifica e taglia. Per convertire l'immagine in scala di grigi in bianco e nero.
Fare clic su Immagine, Tipo e 8 bit. Per regolare il valore della scala di grigi in base alla colorazione delle celle per contare con precisione le particelle di carbonio, vai su Immagine, scegli Regola, Soglia e Applica. Infine, fai clic su Analizza e seleziona Misurazione.
Gli addetti all'imballaggio del nerofumo avevano un contenuto di carbonio più elevato nei macrofagi delle vie aeree rispetto al gruppo di controllo.
