El alcance de nuestra investigación consiste en desarrollar y validar un método no invasivo para medir el contenido de carbono en los macrófagos de las vías respiratorias como biomarcador de la exposición a partículas que contienen carbono. Nuestro objetivo es determinar la exactitud y la fiabilidad de este método de evaluaciones de la exposición individual a gran escala. Nuestro protocolo proporciona un método no invasivo, preciso y estandarizado para medir el contenido de carbono en los macrófagos de las vías respiratorias.
Como biomarcador de exposición interna, se trata de una exposición individual eficaz y precisa a partículas que contienen carbono. Nuestro protocolo ofrece un biomarcador directo y fiable para la exposición individual a partículas que contienen carbono. Este método permite la cuantificación a gran escala utilizando esputo inducido, lo que mejora tanto la precisión como la fiabilidad en comparación con otras técnicas.
Comience recolectando una muestra de esputo de dos mililitros en un tubo de centrífuga. A continuación, añada de 20 a 30 mililitros de la solución fijadora preparada al tubo y mezcle bien el contenido. Para preparar la solución digestiva para la suspensión celular, disuelva 0,1 gramos de ditiotreitol en 100 mililitros de solución salina, de acuerdo con la dosis requerida.
Ahora, centrifuga el tubo que contiene el esputo a 1.998 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, desecha el sobrenadante. Agregue un volumen igual de digestión de esputo al precipitado.
Agite bien la mezcla. Después, coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta que se licuefacción por completo. A continuación, filtre la mezcla licuada con una membrana filtrante de 70 micrómetros.
Centrifugar la solución filtrada a 500 g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante, manteniendo la célula precipitada. Ahora, vuelva a suspender el precipitado celular en el tampón de fosfato de Duchenne.
Centrifugar la solución a 500 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados para obtener un precipitado celular puro. Para la preparación del frotis celular, agregue de 200 a 600 microlitros de tampón de fosfato al sedimento celular y mezcle bien. Luego, toma 20 microlitros de la suspensión celular y crea un frotis celular.
Fije el frotis seco con una solución de tinción disponible en el mercado durante 10 segundos. Después, sumerja el frotis en la solución de tinción A durante ocho segundos. Durante la tinción, levante suavemente el portaobjetos hacia arriba y hacia abajo, luego enjuague el exceso de mancha con agua corriente.
Se observaron pequeños agregados de partículas de carbono negro claramente visibles dentro de las células, variando en la cantidad de partículas de carbono. Para comenzar, tome imágenes de los portaobjetos de esputo teñidos bajo un microscopio. Seleccione al azar macrófagos bien teñidos y morfológicamente intactos y capture sus imágenes.
Con el software ImageJ, mida la escala para obtener una conversión de píxeles precisa. Seleccione Medir y haga clic en Establecer escala. Introduzca la Distancia en píxeles, longitud real, y la Unidad de longitud, micrómetros.
A continuación, marque la opción Global. Ahora, delinea las celdas con una forma irregular y elimina el fondo usando selecciones a mano alzada. En Editar, seleccione Borrar exterior.
Mida el área total de las celdas a través de Analizar y Medir. Recorta el núcleo con Editar y cortar. Para convertir la imagen en escala de grises a blanco y negro.
Haga clic en Imagen, Tipo y 8 bits. Para ajustar el valor de la escala de grises en función de la tinción celular para contar las partículas de carbono con precisión, vaya a Imagen, elija Ajustar, Umbral y Aplicar. Por último, haga clic en Analizar y seleccione Medición.
Los trabajadores del empaquetado de negro de humo tenían un mayor contenido de carbono en los macrófagos de las vías respiratorias que el grupo de control.
