La nostra ricerca si concentra sui neuroni e sui circuiti del sistema somatosensoriale coinvolti nella narrazione degli effetti analgesici dell'agopuntura sul dolore viscerale mentre cerchiamo di regolare le risposte neuronali del neuro DRG agli stimoli dell'agopuntura. I metodi tradizionali, come l'elettroregistrazione, non possono esaminare in modo efficiente il numero sufficiente di cellule e i legami cellulari specifici distinti per identificare i neuroni responsivi viscerali o somatici in vivo. Studiare i ruoli funzionali del neurone DRG nell'effetto analgesico dell'agopuntura è stato difficile a causa dei vincoli tecnologici.
Abbiamo introdotto un approccio generale per osservare la responsabilità di un neurone DRG numero sei nella simulazione intracolonica e di agopuntura in vivo. Il protocollo delinea le procedure per osservare l'attività dei neuroni DRG in vivo in risposta all'input somatico e viscerico. Questo è un miglioramento rispetto allo studio precedente, che si concentrava solo sull'indagine delle risposte neuronali in L5 DRG sotto gli stimoli somatici.
In futuro, con la giusta configurazione, l'imaging CAS in vivo DRG può essere eseguito in segmenti toracici o cervicali, fornendo uno strumento più potente per studiare la nocicezione viscerale e gli effetti dell'agopuntura. Questo metodo è essenziale per i ricercatori di agopuntura. Per iniziare, posizionare il mouse tracheostomizzato in posizione prona sul termoforo.
Praticare un'incisione della linea mediana lunga sette centimetri nella parte bassa della schiena ed estenderla dalla quinta vertebra lombare alla prima vertebra sacrale. Quindi, spostare con cautela i muscoli longissimus lumborum per esporre i processi spinosi delle tre vertebre. Spostare le parti interne del longissimus lumborum bilaterale, i muscoli dorsali della colonna lombare e i muscoli dorsali della semicolonna lombare per esporre i successivi tre processi articolari e mammilari con il segmento di registrazione al centro delle vertebre.
Ora, immobilizza in modo sicuro l'animale con una pinza dentale sui processi articolari bilaterali delle vertebre vicine. Usa la pinza rongeur per rimuovere i processi articolari e mammilari sinistro o destro delle quattro o sei vertebre lombari. Esporre con cura il sei DRG lombare sinistro o destro dopo aver liberato i tessuti connettivi sopra di esso.
Assicurarsi di mantenere intatto l'epinevrio sul lato prescelto delle sei vertebre lombari. Coprire le aree DRG esposte con piccoli batuffoli di cotone imbevuti di soluzione salina per mantenere la condizione attiva. Ora, collega il sistema di erogazione dell'anestesia a basso flusso alla cannula tracheale per intubare i topi.
Posizionare l'animale con il DRG esposto su un cuscinetto riscaldante situato sul tavolino di una pinza spinale personalizzata. Utilizzando due morsetti sulla colonna vertebrale delle vertebre vicine, fissare l'animale per ridurre al minimo il movimento durante il test. Quindi, sostituire i batuffoli di cotone inumiditi con soluzione salina fino a quando l'area chirurgica non è adeguatamente pulita.
Inserire il morsetto spinale personalizzato nel tavolino del microscopio progettato su misura. Per l'imaging, posizionare un obiettivo pneumatico a lunga distanza di lavoro da un microscopio confocale sul DRG esposto. Cattura Z-stack in timelapse dei quattro o sei DRG lombari intatti con risoluzione di 25 micrometri per passo e 512 per 512 o 1, 024 per 1, 024 pixel .
Eseguire la scansione XYZT del DRG con quattro o otto stack, comprendenti da uno a tre stati basali, da due a tre stimoli di agopuntura o di distensione colorettale viscerale e da uno a due stati post-stimoli. Quindi, applica stimoli di spazzolamento o pizzicamento alla parte bassa della schiena, all'arto posteriore o alla zampa posteriore dell'animale per valutare il campo ricettivo più sensibile dei neuroni DRG visualizzati. Somministrare gli stimoli dell'agopuntura manualmente o utilizzando un agopunto e uno stimolatore nervoso disponibili in commercio.
Utilizzare la distensione colorettale con un manometro dell'aria autocostruito per indurre stimoli viscerali. Utilizzando un microscopio confocale, misurare l'aumento della fluorescenza verde del GCaMP neuronale in seguito al legame con il calcio intracellulare in seguito a stimoli somatici o viscerali. Utilizzando il software di imaging, schiarire il video utilizzando l'opzione colore.
Delinea manualmente le cellule visibili e accerta le dimensioni delle cellule e l'intensità relativa della fluorescenza. Esprimere l'intensità della fluorescenza come rapporto tra l'aumento della fluorescenza massima evocata e il livello basale. I sei neuroni DRG lombari generalmente mancano di fluorescenza GFP al basale, probabilmente influenzata dai livelli di espressione di GCaMP e dal danno chirurgico.
Gli stimoli di distensione del colon-retto hanno indotto un aumento rapido e transitorio della fluorescenza GCaMP. Risposte simili sono state osservate con l'applicazione dell'elettroagopuntura BL25. Le mappe di calore e i grafici a linee hanno mostrato le risposte di tutti i neuroni cerchiati alla distensione colorettale e all'elettroagopuntura BL25.
L'istogramma mostra i diametri dei neuroni responsivi alla distensione colorettale e all'elettroagopuntura BL25.
