In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

我们的研究集中在神经元和体感系统的回路上，参与叙述针灸对内脏疼痛的镇痛作用，同时试图调整神经 DRG 对针灸刺激的神经元反应。传统方法（如电记录）无法有效地检查足够的细胞数量和不同的特异性细胞连接，以识别体内的内脏或体细胞反应性神经元。由于技术限制，研究 DRG 神经元在针灸镇痛效果中的功能作用一直很困难。

我们引入了一种通用方法来观察 6 号 DRG 神经元对体内结肠内和针灸模拟的责任。该协议概述了观察体内 DRG 神经元响应体细胞和内脏输入的活动的程序。这是对之前研究的改进，之前的研究仅侧重于调查体细胞刺激下 L5 DRG 中的神经元反应。

将来，通过正确的设置，可以在胸段或颈段进行 DRG 体内 CAS 成像，为研究内脏伤害感受和针灸效果提供更强大的工具。这种方法对于针灸研究人员的学习是必不可少的。首先，将气管切开的鼠标置于加热垫上的俯卧位。

在下背部做一个 7 厘米长的中线切口，并将其从第五腰椎延伸到第一骶椎。然后，小心地将腰长肌移到一边，露出三个椎骨的棘突。移动双侧腰长肌、背侧腰椎肌肉和背侧腰椎半棘肌肉的内部，以暴露连续的三个关节和乳突，记录段位于椎骨中间。

现在，用牙镊将动物牢固地固定在邻近椎骨的双侧关节突上。使用舷骨钳去除腰椎四块或六块椎骨的左侧或右侧关节和乳突。清除上方的结缔组织后，小心地露出左腰椎或右腰椎六 DRG。

确保保持腰椎六椎骨所选一侧的神经外膜完好无损。用浸泡在盐水中的小棉球覆盖暴露的 DRG 区域，以保持活动状态。现在，将低流量麻醉输送系统连接到气管插管以给小鼠插管。

将暴露的 DRG 的动物放在位于定制脊柱夹载物台上的加热垫上。在相邻椎骨的脊柱上使用两个夹子，固定动物以尽量减少测试过程中的运动。然后，更换沾有盐水的棉球，直到手术区域充分清洁。

将定制的脊柱夹插入定制设计的显微镜载物台中。对于成像，将共聚焦显微镜的长工作距离空气物镜放置在暴露的 DRG 上。以每步 25 微米和 512 x 512 或 1， 024 x 1， 024 像素分辨率捕获完整腰部 4 或 6 个 DRG 的延时 Z 堆栈。

使用 4 到 8 堆栈对 DRG 进行 XYZT 扫描，包括 1 到 3 个基线状态、2 到 3 个针灸或内脏结直肠扩张刺激以及 1 到 2 个刺激后状态。然后，对动物的下背部、后肢或后爪施加刷子或捏合刺激，以评估成像的 DRG 神经元最敏感的感受野。手动或使用市售的穴位和神经刺激器进行针灸刺激。

使用自制气压计的结直肠扩张来诱导内脏刺激。使用共聚焦显微镜，测量神经元 GCaMP 在体细胞或内脏刺激后与细胞内钙结合后绿色荧光的增加。使用成像软件，使用颜色选项使视频变亮。

手动描绘可见细胞并确定细胞大小和相对荧光强度。将荧光强度表示为最大诱发荧光增加与基础水平的比率。腰椎 6 个 DRG 神经元通常缺乏基线 GFP 荧光，可能受 GCaMP 表达水平和手术损伤的影响。

结直肠扩张刺激诱导 GCaMP 荧光的快速、短暂增加。使用 BL25 电针应用观察到类似的反应。热图和折线图显示了所有圆圈神经元对结直肠扩张和 BL25 电针的反应。

直方图显示了对结直肠扩张和 BL25 电针有反应的神经元的直径。