I microrganismi che formano biofilm sono un problema importante nell'industria alimentare, compresa l'industria lattiero-casearia. A causa del loro impatto negativo sulla qualità dei prodotti, è importante sviluppare strategie di controllo del biofilm. Questo approccio combina un metodo di screening statico ad alta produttività e un metodo dinamico che imita le condizioni in situ.
Questi due metodi sono complementari per studiare l'efficacia dei disinfettanti contro i biofilm. Questo approccio può essere utilizzato per testare nuove formulazioni biologiche o chimiche per controllare i biofilm nei settori alimentare, medico o ambientale. Inizia vorticando i tubi di coltura batterica di Pseudomonas azotoformans.
Trasferire asetticamente 100 microlitri della coltura batterica in 10 millilitri di brodo di soia triptico sterile o terreno TSB per raggiungere la concentrazione finale di circa due volte 10 al settimo CFU per millilitro. Vortice il tubo di coltura. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 150 microlitri della coltura batterica diluita nei pozzetti della piastra del microtitolo del biofilm in triplice copia.
Caricare 150 microlitri di terreno TSB in tre nuovi pozzi come controllo. Quindi, incubare la piastra del microtitolo del biofilm a 30 gradi Celsius per 24 ore senza agitazione. Pulire e asciugare all'aria le parti del bioreattore prima di posizionare la lama piatta all'interno del becher di vetro da un litro fissato al supporto da una barra magnetica.
Mantenere la configurazione in posizione verticale utilizzando la barra di plastica attaccata al lato interno del coperchio del bioreattore. Utilizzare il cacciavite per posizionare i tagliandi o le guide in acciaio inossidabile sulle loro aste in polipropilene. Inserire tagliandi o diapositive nei fori del coperchio senza posizionare i loro perni di allineamento nelle tacche che consentono al vapore di fuoriuscire durante la sterilizzazione.
Coprire tutte le prese d'aria del bioreattore con un foglio di alluminio e avvolgere il resto dell'attrezzatura, vale a dire il tubo di dimensioni 18 e il tubo di dimensioni 16, il freno di flusso in vetro, i tappi del contenitore, i cacciaviti, le pinze e i filtri da 0,2 micrometri con un foglio di alluminio. Autoclavare il bioreattore installato a ciclo secco a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Per eseguire la prima fase della formazione del biofilm nel bioreattore in modalità batch, all'interno di un armadio di sicurezza biologica, collegare un'estremità del tubo di dimensione 18 al beccuccio di uscita del bioreattore e mantenere l'altra estremità avvolta in un foglio di alluminio.
Rimuovere un coupon o un portavetrino dal coperchio del bioreattore e metterlo in un tubo sterile da 50 millilitri. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica da 50 millilitri, riempire il becher del bioreattore con 340 millilitri di mezzo TSB da 300 milligrammi per millilitro attraverso il foro occupato dall'asta. Per inoculare il terreno di coltura nel bioreattore, aggiungere un millilitro di 10 all'ottavo CFU per millilitro di soluzione batterica azotoformans di Pseudomonas attraverso l'orifizio usando una pipetta da cinque millilitri e riposizionare l'asta nella sua posizione originale.
Posizionare le aste già posizionate nei fori del coperchio affinché i perni si adattino alle rispettive tacche. Quindi posizionare un filtro antiatomico batterico da 0,2 micrometri all'estremità del tubo di diametro più piccolo situato sul coperchio del bioreattore. L'altro tubo dello stesso diametro rimane permanentemente tappato con un tappo a vite metallico o un tappo in silicone che si chiude ermeticamente.
Posizionare il bioreattore per 24 ore sopra la piastra riscaldante impostata a 30 gradi Celsius e mescolare a 130 RPM. Dopo 24 ore, eseguire la seconda fase della formazione del biofilm nel bioreattore in modalità flusso continuo. Mettere una carboy contenente 18 litri di acqua distillata sterile nell'armadio di biosicurezza.
Quindi aggiungere due litri di terreno di coltura TSB da 1000 milligrammi per litro per ottenere una concentrazione finale di 100 milligrammi per litro. Coprire il contenitore con il suo cappuccio sterile a cui sono collegati due tubi. Il primo è un tubo di silicone fissato sull'interfaccia del tappo per pompare il mezzo.
Il secondo tubo, di dimensioni 16, è collegato alla porta esterna che consente al liquido di fluire verso il bioreattore. Dopo aver collegato il tubo di dimensione 16 all'estremità del freno di flusso in vetro, inserire quest'ultimo nel tubo più grande sul coperchio del bioreattore dall'altra estremità e quindi installare il tubo di dimensione 16 nella pompa peristaltica. Utilizzare un'altra carboy da 20 litri per raccogliere l'effluente dal bioreattore.
Attaccare l'estremità del tubo collegato al beccuccio di uscita del bioreattore al tappo del contenitore dei rifiuti. Inserire un filtro da 0,2 micrometri nel tubo presente sul coperchio di questo contenitore. Una volta fatto, avviare la pompa peristaltica a una portata di 11,3 millilitri al minuto e lasciare il sistema in funzione per 24 ore.
Dopo 24 ore, spegnere la pompa peristaltica e smettere di mescolare e riscaldare il bioreattore. Per recuperare il biofilm batterico, sciacquare i tagliandi o i vetrini in 40 millilitri di PBS per eliminare i batteri planctonici. Quindi rilasciarli in un tubo conico sterile da 50 millilitri contenente 40 millilitri di PBS.
Dopo 30 secondi di vortice, sonicare i tubi a 40 kilohertz per 30 secondi. Ripeti questa operazione tre volte. Una volta fatto, raccogliere i 40 millilitri di sospensione di biofilm in un tubo conico sterile da 50 millilitri e risciacquare i tagliandi o i vetrini con due di soluzione PBS sterile.
Recuperare questo liquido di risciacquo e aggiungerlo alla sospensione di biofilm già raccolta. Estrarre la piastra del titolo da 30 gradi Celsius. Aggiungere 200 microlitri di PBS in tre pozzetti di una micropiastra da 96 pozzetti.
Per lavare i biofilm ed eliminare i batteri planctonici, trasferire il coperchio della micropiastra del biofilm con i biofilm formati sui pioli alla micropiastra a 96 pozzetti contenente il PBS per 10 secondi. Preparare i disinfettanti alle concentrazioni richieste e aggiungere 200 microlitri di ciascuna concentrazione di disinfettante nei pozzetti di una nuova piastra di microtitolazione a 96 pozzetti in triplice copia. Trasferire il coperchio della piastra del microtitolo del biofilm sulla piastra di microtitolazione a 96 pozzetti contenente i disinfettanti e incubare la piastra a temperatura ambiente per il tempo di esposizione desiderato.
Quindi, aggiungere 200 microlitri di brodo neutralizzante Dey-Engley ai pozzetti di una nuova piastra di microtitolazione a 96 pozzetti. Trasferire il coperchio della piastra del microtitolatore del biofilm sulla piastra di microtitolazione a 96 pozzetti contenente il brodo neutralizzante. Sigillare la piastra del titolo con parafilm e posizionarla nel sonicatore da bagno a 40 kilohertz per 30 minuti.
Dopo 30 minuti, dalla prima colonna della piastra sonicata, trasferire 100 microlitri di biofilm staccati alla prima fila di una nuova piastra di microtitolazione a 96 pozzetti. Quindi aggiungere 180 microlitri di PBS sterile a una piastra da 96 pozzetti ad eccezione della prima fila. Quindi, trasferire 20 microlitri della soluzione di biofilm dalla prima fila ai pozzetti nella seconda fila contenenti 180 microlitri di PBS per ottenere la diluizione da 10 a meno uno.
Quindi trasferire 20 microlitri dalla seconda fila ai pozzetti nella fila successiva per ottenere la diluizione da 10 a meno due. Ripetere questa operazione per ottenere una diluizione compresa tra 10 e meno cinque e 10 a meno sette. Inoculare 100 microlitri della diluizione desiderata su TSA e incubare le piastre secondo i parametri di crescita del batterio.
Formare i biofilm Pseudomonas azotoformans PFLA 1 sui tagliandi nel bioreattore, rimuovere l'asta che contiene i tagliandi e sciacquare l'asta all'interno di un tubo conico contenente 30 millilitri di PBS per rimuovere le cellule planctoniche. Lascia cadere ogni coupon in un tubo conico sterile da 50 millilitri usando un cacciavite. Quindi aggiungere quattro millilitri della soluzione perossiacida organica appropriata o PBS per il controllo.
Dopo cinque minuti di incubazione, aggiungere 36 millilitri di brodo neutralizzante Dey-Engley. Dopo aver fatto vortice il tubo conico per 30 secondi, sonicarli a 40 kilohertz per 30 secondi. Ripetere il processo tre volte per ottenere la sospensione del biofilm.
Ripetere la stessa procedura con le altre aste, preparare i deliri seriali della sospensione del biofilm e placcare la sospensione su supporto TSA come descritto in precedenza. L'analisi SCM ha mostrato la presenza del biofilm di Pseudomonas azotoformans PFL1A sui picchetti della micropiastra del biofilm. Il biofilm Pseudomonas azotoformans PFL1A formato su un vetrino di acciaio inossidabile utilizzando un bioreattore appariva molto denso e mostrava le caratteristiche morfologiche di un biofilm tridimensionale maturo.
I risultati della conta batterica dei biofilm sviluppati da questo isolato nel sistema dinamico hanno mostrato densità cellulari significative corrispondenti a 8,74 CFU log per centimetro quadrato nel terreno di coltura TSB e 7,86 CFU centimetro quadrato logato nel latte scremato sterile. I risultati ottenuti con l'isolato di B.vesicularis hanno mostrato che l'aumento della concentrazione di nutrienti da 100 a 900 milligrammi per litro ha determinato un aumento della carica batterica dei biofilm da 6,11 a 8,71 log CFU centimetro quadrato. Inoltre, è stata osservata una crescita significativa del biofilm quando la portata è stata ridotta a 6,0 millilitri al minuto, indicando che alcuni fattori potrebbero influenzare la formazione di biofilm nel bioreattore.
Nessuno dei biofilm conteneva cellule vitali rilevabili a cinque minuti di contatto in 500 parti per milione con perossiacidi organici e 100.000 parti per milione con concentrazioni di perossido di idrogeno di disinfettanti solitamente applicati negli impianti lattiero-caseari. L'SCM ha mostrato la struttura tridimensionale della concentrazione minima di eradicazione del biofilm non trattato o biofilm MBEC, mentre i biofilm MBEC trattati hanno perso la loro conformazione tridimensionale. È essenziale rimanere sterili durante l'esecuzione di questo protocollo.
Inoltre, l'utente deve ricordare che i risultati generati sono associati a un isolato e disinfettante univoci. La combinazione di disinfettante con vibrazioni meccaniche, ultrasuoni o trattamenti enzimatici potrebbe essere valutata per migliorare l'efficacia dell'eradicazione del biofilm. Questo approccio che utilizza metodi statici e dinamici per formare biofilm ha spianato la strada ai ricercatori per esaminare e studiare nuove formulazioni anti-biofilm per controllare meglio i biofilm in vari settori.
