Parlando di significato, la generazione di cellule NK da una fonte espandibile è fondamentale per applicazioni come l'immunoterapia del cancro. Il vantaggio di questa tecnologia è che le cellule staminali potenziali espanse che possiedono una più ampia capacità di differenziazione possono essere utilizzate al posto delle normali cellule IP. Per la predifferenziazione degli hEPSC, rimuovere il mezzo hEPSC in cui sono state mantenute le celle e aggiungere un millilitro di mezzo DFK.
Incubare per due o tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per verificare la formazione di corpi embrioidi, dopo aver rimosso il mezzo DFK esaurito, lavare le cellule una volta con un millilitro di PBS. Aggiungere 500 microlitri di tripsina allo 0,05% e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre-sette minuti, in base alla morfologia.
Una volta rimossa la tripsina, e due millilitri di DFK mezzo per raccogliere le cellule. Centrifugare le cellule a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere un millilitro di mezzo DFK e un microlitro di Y-27632 e risospendere le celle scorrendo.
Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare con mezzo DFK e Y-27632 per ottenere 4.000 cellule per 25 microlitri di mezzo. Posizionare da 30 a 40 gocce di sospensione cellulare sul cappuccio di una piastra di Petri di 10 centimetri e versare un po 'di PBS nel piatto inferiore per impedire l'evaporazione delle goccioline. Capovolgere delicatamente il tappo per coprire il piatto e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre giorni.
Per raccogliere i corpi embrioidi dalla goccia, usando una pipetta da un millilitro contenente PBS, pompare un po 'di PBS nella goccia e aspirare il mezzo, compresi i corpi embrioidi. Quindi, trasferire questi corpi embrioidi in un tubo da 15 millilitri e farli girare a 100 G per un minuto a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere un millilitro di mezzo A.Trasferire i corpi embrioidi raccolti in una piastra a 24 pozzetti non aderente e considerarlo giorno zero.
Per eseguire il pattern mesodermico dei corpi embrioidi, incubare la piastra per tre giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il secondo giorno, sostituire 500 microlitri di mezzo A esaurito con mezzo A fresco dello stesso volume. Per eseguire la specifica ematoendoteliale del corpo embrioide, rimuovere 700 microlitri di mezzo A dal pozzetto e aggiungere lo stesso volume di mezzo B.Coltura per sette giorni, cambiando il mezzo mezzo ogni due giorni.
Per trasferire i corpi embrioidi modellati su un'interfaccia aria/liquido, inclinare leggermente la piastra in modo che i corpi embrioidi si aggreghino nella parte inferiore e, utilizzando una pipetta da un millilitro, rimuovere il più possibile il mezzo B. Ora raccogli i corpi embrionali con una pipetta aspirando il mezzo rimanente e trasferiscili in un trans-pozzetto in una piastra a 24 pozzetti, Per eseguire l'espansione del progenitore linfoide, aggiungere 500 microlitri di mezzo NK-1 al compartimento inferiore del trans-well, coltura per 14 giorni ed eseguire un cambio di mezzo a giorni alterni. Per rivestire la piastra, diluire il materiale di rivestimento in PBS, aggiungere un millilitro di soluzione di rivestimento diluita a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e coprire l'apertura della piastra con pellicola avvolgente.
Incubare la piastra a quattro gradi Celsius durante la notte. Aggiungere 200 microlitri di PBS nel trans-pozzetto e pipettare lentamente su e giù circa cinque o sei volte per raccogliere le cellule rilasciate dagli organoidi. Trasferire la sospensione cellulare raccolta in un tubo da due millilitri e far girare le cellule a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule in un millilitro di mezzo NK-1. Rimuovere tutta la soluzione di rivestimento dal pozzetto e lavare ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con un millilitro di PBS due volte. Quindi, dividere le celle raccolte in un rapporto di 1: 2 e trasferire la sospensione cellulare su una piastra rivestita a 12 pozzetti.
Aggiungi un millilitro di mezzo NK-1 in modo che ogni pozzetto abbia 1,5 millilitri di mezzo. Per cambiare il mezzo, lasciare che le celle affondino sul fondo per uno o due minuti. Quindi, aspirare con cura 750 microlitri di mezzo e farlo girare verso il basso come dimostrato in precedenza.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet ottenuto in 750 microlitri di mezzo NK-1 mediante pipettaggio da cinque a sei volte e trasferirlo nel pozzetto originale. Nel presente studio, sono stati analizzati i prodotti derivati da hEPSC all'endpoint. Circa il 15% delle cellule dissociate dal sistema di coltura 3D da due lotti indotti in diversi punti temporali erano CD3-negativi, CD56-positivi e il 16% delle cellule erano CD45-positivi, CD-56-positivi, che è in linea con le percentuali di cellule CD3-negative, CD56-positive osservate in studi precedenti.
Le percentuali di cellule CD3-negative, CD56-positive nelle cellule raccolte dal sistema di coltura 2D variavano dal 30 al 6% I prodotti derivati da hEPSC durante la coltura del giorno 18 dal sistema 2D hanno mostrato espressione di CD56 e CD107a ectopici nel 12% delle cellule dopo due ore di stimolazione anticorpale e circa il 28% delle cellule raccolte erano CD94-positive, CD159a-positivo. I prodotti di differenziazione in vitro sono stati testati per la citotossicità contro le cellule eritroucemiche umane K562. Quando co-coltivati con bersagli tumorali per tre ore, i prodotti differenziati mostrano una lieve citotossicità rispetto a una linea cellulare permanente NK92mi indipendente dall'interleuchina 2.
Seguendo questo metodo, possono essere generate cellule come cellule T, cellule B ed eritrociti.
