Questo metodo consente di studiare formazioni di complessi proteici che richiedono co-espressione per campioni di prova efficienti, come la formazione di eterodimeri. Il principale potenziale finale di questo metodo è lo sfruttamento della co-espressione di proteine studiate differenzialmente marcate utilizzando combinazioni di vettori compatibili per promuovere un assemblaggio complesso efficiente, insieme a un flusso di lavoro e una scalabilità efficienti in termini di tempo che consentono un rapido patch-test di interazioni multiple. Questo metodo può essere utilizzato anche per lo screening rapido dell'espressione proteica ottimale e delle condizioni di purificazione.
La dimostrazione visiva consente di eseguire correttamente i passaggi critici del protocollo, ad esempio la configurazione della co-espressione, l'interruzione delle celle e le successive fasi di pulldown. Per iniziare, coltiva il ceppo Escherichia coli BL21 (DE3) in Luria-Bertani, o LB, mezzi a 37 gradi Celsius a una densità ottica, o OD, da 0,1 a 0,2. Centrifugare un millilitro della sospensione batterica per un minuto a 9.000 G a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.
Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di trasformazione ghiacciato, o TB, e incubare per 10 minuti sul ghiaccio. Alla fine dell'incubazione, centrifugare per 30 secondi a 8.000 G a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone TB, 100 nanogrammi di ciascun vettore e incubare per 30 minuti su ghiaccio.
Riscaldare a 42 gradi Celsius per 150 secondi, quindi raffreddare sul ghiaccio per un minuto. Quindi, aggiungere un millilitro di media LB senza antibiotici e incubare a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare e risospendere il pellet in 100 microlitri di mezzi LB prima di placcare la sospensione su una piastra di agar LB contenente lo 0,5% di glucosio e antibiotici corrispondenti.
Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare le cellule dalla piastra con due millilitri di mezzi LB in 50 millilitri di media LB con antibiotici corrispondenti. Aggiungere ioni metallici o altri cofattori noti prima di conservare un'aliquota con glicerolo al 20% a meno 70 gradi Celsius per esperimenti successivi.
Fai crescere le cellule con una rotazione costante di 220 RPM a 37 gradi Celsius a un OD da 0,5 a 0,7. Raffreddare la coltura a temperatura ambiente e aggiungere IPTG a una concentrazione finale di un millimole. Conservare un'aliquota da 20 microlitri di sospensione cellulare come controllo del campione non indotto.
Incubare le cellule durante la notte a 220 RPM a 18 gradi Celsius. Il giorno successivo, dividere la sospensione batterica in due parti e conservare aliquote da 20 microlitri per confermare l'espressione proteica. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 4.000 G per 15 minuti.
Per il test di pulldown, risospendere i pellet in un millilitro di tampone di lisi ghiacciato con inibitori della proteasi e agenti riducenti aggiunti immediatamente prima dell'esperimento. Regolare la composizione del tampone per le proteine testate. Interrompere le cellule mediante sonicazione sul ghiaccio e conservare un'aliquota da 20 microlitri per l'elettroforesi.
Centrifugare a 16.000 G per 30 minuti e raccogliere 20 microlitri di lisato chiarificato per elettroforesi. Equilibrare la resina con un millilitro di tampone di lisi ghiacciato per 10 minuti, quindi centrifugare a 2.000 G per 30 secondi e scartare il surnatante. Aggiungere lisati cellulari alla resina e incubare per 10 minuti ad una rotazione costante di 15 RPM.
Quindi, centrifugare e scartare il surnatante prima di raccogliere 20 microlitri della frazione non legata per l'analisi. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio ghiacciato e incubare per un minuto. Ancora una volta, centrifugare e scartare il surnatante.
Quindi, eseguire due lavaggi lunghi con tampone di lavaggio ghiacciato. Dopo il secondo lavaggio, eluire le proteine legate con 50 microlitri di tampone di eluizione in uno shaker a 1.200 RPM a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Analizzare le proteine eluite con l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS.
Gli studi sul dominio associato alle dita di zinco, o ZAD, l'omo-dimerizzazione nella proteina legante il maltosio, o MBP, e i saggi di pulldown 6xHistidine sono mostrati qui. La co-espressione di ZAD fusi con MBP e tioredossina 6xIstidina mostra una buona e riproducibile attività di omodimerizzazione, apparendo come una banda aggiuntiva nei risultati SDS-PAGE del saggio di pulldown MBP. Un altro esempio di utilizzo del metodo per studiare la formazione complessa alternativa è mostrato qui.
Nel test di co-espressione, ENY2 marcato con 6xIstidina ha interagito sia con Sgf11 marcato con GST che con MBP-CTCF, ma nessun GST-Sgf11 era presente nei pulldown MBP e viceversa. Qui viene mostrato un confronto passo-passo degli intervalli di tempo richiesti nel flusso di lavoro del test di pulldown convenzionale rispetto al pulldown accoppiato alla co-espressione. I risultati dell'utilizzo di entrambe le tecniche per studiare la stessa interazione tra il dominio BTB della proteina CP190 e il dominio C-terminale marcato GST della proteina Drosophila CTCF sono mostrati qui.
La scelta corretta del test di affinità e solubilità, tioredossina, GST o MBP, è fondamentale per l'esecuzione efficiente del test. Un altro passo fondamentale è la distruzione cellulare rapida e uniforme. Si consiglia vivamente di utilizzare sonde sonicator multi-tip.
Questo metodo consente lo studio diretto della formazione di eterodimeri tra domini proteici che altrimenti formano omodimeri che non si dissocierebbero durante l'incubazione di proteine purificate nel saggio pulldown convenzionale.
