Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Mental Health (R00MH103531 e R01MH116901 a J.A.), una borsa di formazione pre-dottorato del National Institute of General Medicine (da T32GM007635 a S.R.) e una Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). Ringraziamo il Dr. Kevin Woolfrey per l'aiuto al microscopio, il Dr. K Ulrich Bayer per l'uso del suo microscopio epifluorescente e Thomas Südhof (Stanford University) per il plasmide LRRTM2.

1. Coltura cellulare e trasfezione
<ol><li>Rendere i supporti cellulari HEK con DMEM, 1x (Modifica del mezzo dell'aquila di Dulbecco) integrati con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio e FBS al 10%. Filtro sterile.</li>
	<li>Predeterminare ligandi e recettori adatti per il test di aggregazione. NOTA: Neurexin3α SS4+/- e uno dei suoi ligandi noti, LRRTM2, sono stati utilizzati in questo studio. Ligandi e recettori di interesse sono stati espressi da cDNA in pcDNA3.1. Un assieme Gibson è stato utilizzato per inserire Neurexin3α in pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCATGAGCTTTACCCTCCACTC/ GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Preparare le celle HEK293T.<ol>
<li>Far crescere le cellule HEK293T fino alla confluenza in un pallone T-75.</li>
		<li>Una volta confluente, utilizzare 2 mL di tripina e posizionare in un incubatore a 37 °C per 2 minuti. Aggiungere 6 ml di supporti HEK al pallone per rimospendare le celle e trasferire tutti gli 8 ml in un tubo conico da 15 ml.</li>
		<li>Pellet a 500 x g per 5 min e resuspend in supporti cellulari HEK per un totale di 8 mL.</li>
		<li>Contare le cellule e aggiungere 735.000 celle in ogni pozzo di una piastra a 6 po'. Regolare il volume finale a 2 mL per ogni pozzo utilizzando il supporto cellulare HEK.</li>
		<li>Mettere in incubatrice a 37 °C e lasciare che le cellule crescano durante la notte o fino a raggiungere il 50-60% di confluenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasfetto cellule HEK293T utilizzando il metodo del fosfatodi calcio 13.<ol>
<li>Trasfetto bene-1 con 3 μg della proteina di interesse e co-trasfettura con 1 μg di proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- e 1 μg di mCherry).</li>
		<li>Trasfetto bene-2 come nel passaggio 1.4.1. ma con la proteina mutata di interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Trasfetto bene-3 con 3 μg del ligando di interesse e co-trasfetto con 1 μg di un'altra proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg di GFP).</li>
		<li>Trasfetto bene-4 e ben 5 per servire come controlli negativi: ben-4 con 1 μg di GFP e ben-5 con 1 μg di mCherry.</li>
		<li>Preparare un'altra piastra (come nel passaggio 1.4.1-1.4.4) se si richiedono condizioni o controlli aggiuntivi (Neurexin3αWT/A687T SS4+). NOTA: L'efficienza della trasfezione viene analizzata 24 ore dopo la trasfezione al microscopio a epifluorescenza e quantificata come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente con cui sono state trasfette. Un approccio più snello includerebbe la trasfezione delle cellule HEK con una codifica vettoriale bicistronica per una proteina fluorescente e il ligando di interesse ed è altamente raccomandato sopra la co-trasfezione. Nel caso di questo studio, le neuressine alfa sono ~ 4,3 kb e la bassa intensità di fluorescenza è stata osservata usando un sistema bicistronico che richiede la co-trasfezione.</li>
	</ol></li>
	<li>48 ore dopo la trasfezione, cellule di raccolta per l'aggregazione.<ol>
<li>Lavare ogni bene due volte con PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di EDTA da 10 mM in PBS in ogni pozzo per dissociare delicatamente le interazioni da cellula a cellula e incubare la piastra a 37 °C per 5 min. NOTA: La tripsidena non è raccomandata per il passaggio 1.5.2 a causa della potenziale scissione proteolitica delle molecole di adesione in studio. Inoltre, dopo l'aggiunta di EDTA, il protocollo potrebbe non essere interrotto fino al completamento poiché le celle saranno ora esposte a condizioni ambientali.</li>
		<li>Toccare delicatamente la piastra per staccare le celle e raccoglierla in tubi conici separati da 15 ml.</li>
		<li>Centrifuga tubi conici a 500 x g e temperatura ambiente per 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Mentre le cellule sono in pellettizzazione, preparare 6 tubi di incubazione etichettando la parte superiore di ogni tubo di microcentrifugo ad ogni condizione. NOTA: Ogni permutazione delle condizioni GFP e mCherry deve essere utilizzata per comprendere tutte le condizioni sperimentali e i controlli adeguati. Ad esempio: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP. Crea tubi aggiuntivi per adattarsi a ulteriori condizioni e controlli.</li>
	<li>Rimuovere le cellule supernatanti e resuspend in 500 μL di mezzi HEK con CaCl2 da 10 mM e MgCl2 da 10 mM riscaldati a 37 °C. NOTA: L'aggiunta di CaCl2 e MgCl2 consente alle molecole di adesione di ristabilire il legame ed è necessaria solo se i partner di interazione transcellulare in questione richiedono formazioni divalenti per l'adesione.</li>
	<li>Contare le cellule in ogni tubo conico da 15 ml utilizzando un emocitometro e aliquote 200.000 celle di ciascuna condizione in un tubo appropriato dal passo 1.6.1 per una miscela 1:1 in un volume totale di 500 μL. NOTA: Per contare e aliquota devono essere previsti solo 5 minuti per condizione.</li>
	<li>Incubare i tubi a temperatura ambiente in un rotatore a tubo lento.</li>
</ol>2. Acquisizione di immagini
<ol><li>Ottimizzare i parametri di acquisizione del microscopio per campioni specifici. In questo esempio, le immagini sono state scattate su un microscopio a campo largo. Utilizzare un obiettivo 5x air (NA: 0.15; WD: 20000 μm) per ottenere un campo abbastanza grande per l'analisi.</li>
	<li>Valutare l'aggregazione di base immediatamente dopo aver mescolato le due condizioni delle celle HEK nel passaggio 1.8. Queste sono ora le immagini 'time zero'.<ol>
<li>Pipetta 40 μL di ogni miscela di campioni su un vetrino del microscopio caricato e immagine sotto fluorescenza sia nei canali 488 che 561.</li>
		<li>Acquisire tre diversi campi di visualizzazione con un piano di messa a fuoco per goccia di esempio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acquisisci le immagini finali a 60 minuti come immagine "tempo 60".<ol>
<li>Per ottenere l'immagine "tempo 60" della miscela dopo un'incubazione di 60 minuti, prendere un altro campione di 40 μL di ciascuna condizione da tubi rotanti e pipettare ogni campione su uno scivolo carico. Immagine come nel passaggio 2.2.2. NOTA: l'aggregazione cellulare deve essere controllata ogni 15 minuti fino a quando non si verifica la saturazione. La tempistica dell'aggregazione dipenderà dalle proteine testate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analisi ImageJ/Fiji
<ol><li>Per quantificare l'estensione dell'aggregazione utilizzando Fiji/ImageJ, salvare i file di analisi.<ol>
<li>Salvare i file di codifica supplementari forniti nella cartella imageJ macros del computer.</li>
		<li>Installare la macro di aggregazione fornita (Plugin, Macro, Installa e selezionare il file "AggregationAssay.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare le soglie.<ol>
<li>Caricare un 'time zero' .tif file in imageJ e dividere i canali (Image | Colore | Canali divisi). NOTA: l'immagine 'time zero' viene utilizzata per determinare la soglia e la dimensione minima del puncta per l'intero esperimento.</li>
		<li>Maschera ogni canale(plugin | Macro | AggregationAssay_MakeMask). Verrà visualizzata la finestra Crea maschera da immagine. Accanto a Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params from Histogram e fare clic su OK.</li>
		<li>Determinare la soglia dell'immagine utilizzando la barra delle diapositive, registrare il numero a destra della barra della diapositiva e fare clic su OK.</li>
		<li>Verrà visualizzato un istogramma delle dimensioni del cluster. Selezionare una dimensione del cluster dall'istogramma adatto all'esperimento, digitare questo numero nella casella Dimensioni cluster minimo: e fare clic su OK. I cluster al di sotto di questa dimensione non verranno analizzati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'analisi.<ol>
<li>Aprire l'immagine "tempo 60" della condizione 1 in imageJ e dividere i canali come nel passaggio 3.2.1.</li>
		<li>Maschera ogni canale (plugin, macro, AggregationAssay_MakeMask). Utilizzare la stessa soglia e dimensione determinata nel passaggio 3.2.3 e nel passaggio 3.2.4. Deselezionare le caselle accanto a Determina soglia per immagine e Determinare i parametri cluster dall'istogramma e digitare manualmente le dimensioni e le soglie nei campi appropriati, quindi fare clic su OK.</li>
		<li>Calcolare l'indice di aggregazione (Plugins | Macro | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selezionare i canali mascherati da confrontare e la directory in cui verranno salvate i file risultanti.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.3 per ogni immagine "tempo 60" in ogni condizione. NOTA: L'indice di aggregazione è definito come l'area di sovrapposizione totale divisa per la somma delle due aree di canale meno l'area di sovrapposizione moltiplicata per 100 (indice di aggregazione = area di sovrapposizione/[area del canale 1 + area del canale 2 – area di sovrapposizione] x 100). Questa normalizzazione è un'operazione 'OR' tra i due canali mascherati che rappresentano i pixel totali in entrambe le maschere.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sezionare le interazioni proteina-proteina che si verificano in trans durante l'adesione cellulare può portare a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei processi cellulari di base tra cui la formazione, la funzione e il mantenimento delle sinapsi durante la maturazione e il rimodellamento. Le implicazioni delle interazioni cellula-cellula si espandono oltre la neurobiologia e hanno ruoli più ampi nella trasduzione del segnale, nella migrazione cellulare e nello sviluppo deitessuti 14. Le aberrazioni nell'adesione cellulare possono interrompere i processi cellulari imperativi per una corretta funzione cellulare e possono sottoscrivire una varietà di eziologie come cancro, artrite, dipendenza, autismo e schizofrenia1,15,16. Qui viene fornito un protocollo dettagliato ottimizzato che coinvolge l'aggregazione di celle HEK che consente di testare le interazioni di adesione delle celle in trans.
Con questo protocollo di aggregazione cellulare HEK, possiamo sezionare le differenze di aggregazione per approssimare la capacità di legame tra una proteina presnaptica e il suo ligando postinaptico. Come tale, possiamo porre domande come: l'interazione tra due proteine sinaptiche essenziali è influenzata da una mutazione puntile? Più specificamente, l'interazione trans di Neurexin3α con LRRTM2 è influenzata da A687T? La mutazione missense A687T studiata qui si trova in una regione di linker precedentemente non studiata del dominio extracellulare di Neurexin3α7. I risultati illustrano che la mutazione A687T migliora l'aggregazione delle cellule contenenti Neurexin3αA687T alle cellule contenenti LRRTM2 (Figura 2C). Questa scoperta è significativa perché è stato precedentemente dimostrato che gli LRTM si legano solo alle Neurexins attraverso un dominio di Neurexin chiamato LNS617, e suggerisce inoltre che le sequenze a monte di LNS6 possono esercitare un effetto indipendente sulle interazioni trans tra Neurexin3α SS4- e LRRTM27.
I risultati della figura 2 mostrano la specificità di questo saggio come tutti i controlli negativi (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP o LRRTM-GFP/mCherry) non aveva aggregazione osservabile dopo 60 minuti. Un controllo critico utilizzato in questo studio, Neurexin3αWT/A687T SS4+ — mCherry/LRRTM-GFP, non ha mostrato alcuna aggregazione dopo 60 min perché LRRTM2 è noto per legarsi esclusivamente a SS4 privo (SS4-) isoforme di Neurexin. Questo controllo dimostra che la semplice sovraespressione di molecole legate alla membrana non è sufficiente a forzare l'aggregazione in questo sistema, il che illustra ulteriormente la specificità di questo saggio.
Il saggio di adesione cellulare qui descritto è stato ampiamente utilizzato per testare le interazioni delle molecole di adesione cellulare transsinaptica8,18,19; tuttavia, può essere utilizzato per testare le interazioni adesive da cellula a cellula di proteine tethered a membrana. Questo protocollo, che si è evoluto nel tempo, è stato ottimizzato dal protocollo originale pubblicato e dalle successive variazioni del protocollo modificando tre parametri sperimentali. Uno, la temperatura di incubazione per le cellule è stata cambiata. Il protocollo originale prevede l'incubazione di cellule nella fase 1.9 a 4 °C. Questa bassa temperatura può agire come stressante ambientale e può ridurre la vitalità cellulare portando alla morte cellulare e allalisi. Durante la lisi cellulare, le cellule secernono DNA genomico e detriti cellulari in mezzi che causano l'accumulo di cellule in soluzione che porta a falsi positivi durante l'imaging. In secondo luogo, il numero di cellule per condizione è stato aumentato a 200.000 per popolazione e la dimensione oggettiva è stata cambiata in 5x; ciò consente al ricercatore di visualizzare un maggior numero di interazioni per campo visivo al fine di aumentare il potere statistico all'interno di ogni n. In terzo luogo, l'indice di aggregazione è stato misurato in modo diverso. I precedenti indici di aggregazione erano limitati dalla selezione delle dimensioni del cluster da parte dello sperimentatore che portava all'esclusione dei cluster "subreshold". Al contrario, le soglie sono ora fissate per la dimensione delle singole cellule al 'tempo zero', e l'aggregazione è ora calcolata come l'area sovrapposta divisa per la somma delle due aree del canale meno l'area di sovrapposizione moltiplicata per 100 al 'tempo 60' che consente l'inclusione di cluster positivi più piccoli rendendo il saggio più sensibile ad altre coppie proteina-ligando(Figura 2B,C).
La risoluzione dei problemi e l'ottimizzazione possono essere necessarie a seconda delle proteine interagenti testate. Sebbene il periodo di incubazione fino all'acquisizione finale dell'immagine differirà a seconda delle proteine testate, è fondamentale che non si osservi alcuna aggregazione al 'tempo zero'. Se l'aggregazione viene vista al tempo zero, può implicare che le cellule non erano sane per cominciare. Ciò può essere dovuto a diversi fattori, tra cui l'esposizione improvvisa a temperature inferiori a 37 °C o una procedura sperimentale lenta. È importante sottolineare che il supporto di sospensione per il passaggio 1.7 dovrebbe essere a 37 °C, il che consentirà alle cellule di raggiungere gradualmente la temperatura ambiente senza un improvviso e duro calo di temperatura. Un modo per avere una salute ottimale delle cellule durante l'esperimento è garantire che i passaggi da 1,7 a 1,9 siano completati entro un intervallo di tempo di 25 minuti senza interruzioni nel mezzo. Si raccomanda che il microscopio sia configurato e pronto per l'uso prima delle cellule di raccolta cellulare nel passaggio 1.5; ciò garantisce che una vera immagine "time zero" possa essere scattata immediatamente nel passaggio 2.2.
Se l'aggregazione non viene osservata dopo 60 minuti di incubazione, diversi fattori possono contribuire a questa mancanza di adesione. In primo luogo, le proteine in questione potrebbero non essere partner vincolanti o possono impegnarsi in interazioni a bassa affinità non rilevabili da questo saggio. In questo caso, potrebbe essere necessario un saggio più sensibile.  In secondo luogo, le proteine di interesse potrebbero non localizzare la membrana se espresse da sole nelle cellule HEK. In questo caso, confermare che la proteina è membrana localizzata utilizzando tecniche biochimiche (biotinylazione superficiale) o etichettare direttamente la proteina di interesse con un tag fluorescente e un'immagine cellule HEK293T a ingrandimento 40x o superiore per valutare l'espressione superficiale. Tuttavia, dopo la conferma della localizzazione della membrana, si consiglia di utilizzare varianti non registrate per questo test di aggregazione cellulare HEK al fine di valutare più accuratamente la capacità di legame della proteina nativa. In terzo luogo, in questo protocollo abbiamo permesso a Neurexin3α di esprimere per 48 h; tuttavia, il tempo di espressione delle proteine può variare a seconda delle proteine testate. In quarto luogo, è fondamentale integrare i mezzi nella fase 1.7 con MgCl2 e CaCl2 se le proteine in questione dipendono da formazioni divalenti, come nel caso dell'esempio di Neurexins e LRRTM211. Se non si sa se i partner di interazione richiedano formazioni divalenti per l'adesione, aggiungere l'EDTA in una condizione. L'EDTA deve inginominare le formazioni naturalmente presenti in DMEM garantendo una soluzione priva di calcio e magnesio. Se l'adesione viene osservata dopo l'aggiunta di EDTA, le proteine in questione non richiedono formazioni divalenti per l'adesione.
Esistono molti metodi per testare le interazioni proteiche; tuttavia, la maggior parte non è specifica per testare solo le interazioni trans che si verificano da una cellula all'altra e richiedono noiose fasi di purificazione delle proteine. Sebbene il saggio di aggregazione cellulare HEK non sia una misura diretta dell'affinità e non debba essere usato per sostituire un approccio più quantitativo per recuperare costanti di dissociazione, al meglio delle nostre conoscenze, questo saggio rappresenta un approccio per testare le vere interazioni trans in modo semi-quantitativo e relativamente efficiente. Inoltre, a causa della relativa facilità di questo saggio, il saggio di aggregazione cellulare HEK può essere usato in combinazione con questi approcci più quantitativi per ottenere una caratterizzazione più ampia e completa delle interazioni in corso.

Le interazioni sinaptiche facilitate dalle molecole di adesione sinaptica sono fondamentali per lo sviluppo, l'organizzazione, le specifiche, il mantenimento e la funzione delle sinapsi e la generazione di reti neurali. L'identificazione di queste molecole di adesione delle cellule transsinaptiche è in rapido aumento; pertanto, è fondamentale identificare partner vincolanti e capire come queste nuove molecole di adesione interagiscono tra loro. Inoltre, il sequenziamento del genoma ha identificato mutazioni in molte di queste molecole di adesione che sono comunemente collegate a una moltitudine di disturbi del neurosviluppo, neuropsichiatrici e della dipendenza1. Mutazioni nei geni che codificano per molecole sinaptiche di adesione cellulare possono alterare negativamente le interazioni trasmissibili e possono contribuire ad alterazioni fisiopatiche nella formazione e o nel mantenimento della sinapsi.
Esistono più saggi per valutare quantitativamente le interazioni proteina-proteina come la calorimetria isotermica, il dicroismo circolare, la risonanza plasmonicasuperficiale 2 e, sebbene di natura quantitativa, hanno diversi limiti. In primo luogo, richiedono proteine ricombinanti, a volte richiedendo lunghi e noiosi passaggi di purificazione. In secondo luogo, richiedono sofisticate attrezzature specializzate e competenze tecniche. In terzo luogo, possono sopravvalutare l'estensione del legame in quanto consentono sia interazioni cis che trans tra proteine che sono naturalmente legate a una membrana in vivo. Qui proponiamo un saggio semplice e relativamente rapido che testa esclusivamente le interazioni trans.
Per aggirare molte delle complicazioni associate ai test proteici purificati, abbiamo ottimizzato un saggio di interazione proteica a base cellulare che riassume le interazioni trans in un sistema di cellule eterologhe ridotto. Questo saggio è stato precedentemente utilizzato in varie forme per studiare le interazioni transcellulari. In questo approccio, le molecole di adesione delle cellule candidate vengono trasfette in cellule HEK293T. In condizioni fisiologiche, le cellule HEK293T non mostrano auto-aggregazione, rendendole modelli esemplari per questo saggio. Tuttavia, quando vengono combinate singole popolazioni di cellule HEK che esprimono recettore e ligando, il legame del recettore e del ligando forza l'aggregazione delle cellule HEK. Questa aggregazione è mediata esclusivamente da interazioni trans ed è solitamente osservabile in decine di minuti. Non sono necessari passaggi di purificazione delle proteine in questo metodo, e l'efficienza del metodo si basa sul paradigma che le popolazioni di cellule HEK che esprimono molecole di adesione affini vengono combinate e quindi immaginiate solo decine di minuti dopo. Inoltre, questo metodo è relativamente economico, in quanto non sono necessari né anticorpi né attrezzature costose. L'unica apparecchiatura necessaria per l'acquisizione dei dati è un microscopio fluorescente standard. Un ulteriore vantaggio di questo saggio basato sulle cellule è la capacità di migliorare rapidamente l'effetto delle mutazioni puntili rilevanti della malattia sulle interazioni trans. Questo può essere eseguito trasfettando le cellule HEK con cDNA delle varianti mutanti della proteina di interesse.
In questo protocollo, presentiamo un esempio in cui studiamo se una mutazione missense in Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificata in un paziente a cui è stata diagnosticata una profonda disabilità intellettiva ed epilessia, altera le interazioni in trans con la proteina transmembrana ripetuta ricca di leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α è un membro della famiglia evolutivamente conservata di molecole di adesione cellulare presinaptica e mentre recenti lavori hanno identificato molteplici ruoli alla sinapsi3,4, 5,6,7, la nostra comprensione sinaptica di questa molecola e di tutti i membri della famiglia delle neuressine rimane incompleta. LRRTM2 è una proteina di adesione a cellule postsinaptiche eccitatorie che partecipa alla formazione e al mantenimento della sinapsi8,9,10. È importante sottolineare che LRRTM2 interagisce esclusivamente con le isoforme di neurexina che mancano dell'esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4-) ma non con isoforme di neuresina contenenti l'esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4+). La mutazione del missense umano (A687T) identificata in Neurexin3α si trova in una regione extracellulare non studiato che è conservata evolutivamente e viene conservata tra tutte le neuressine alfa7. Poiché l'interazione tra queste due molecoleè stata stabilita 8,9,11, abbiamo posto la domanda: la capacità di legame di Neurexin3α SS4- a LRRTM2 è alterata da una mutazione puntile A687T? Questo saggio ha rivelato che la mutazione del punto A687T ha inaspettatamente migliorato l'aggregazione di Neurexin3α a LRRTM2 suggerendo che la regione extracellulare in cui si trova la mutazione puntile, gioca un ruolo nella mediazione delle interazioni transsinattiche.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Incubation of mixed population of HEK cells</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&amp;mdash;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Sterilization of HEK media</td></tr><tr><td>15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td><td>Ward&amp;rsquo;s Science</td><td>470224-998</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>6 well sterile tissue culture plates</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>culturing HEK cells</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td></tr><tr><td>Centrifuge- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>75004377</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>CO2 cell incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Incubation of HEK cells during growth</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco&#039;s Modification of Eagle&#039;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &amp;amp; sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>HEK cell maintenance</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Passaging/harvesting HEK cell</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>Falcon Vented culture flasks, 75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; growth area</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Culturing HEK cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>HEK cell maintenance</td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>Model system</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Image analysis</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride hexahydrate</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>HEK cell resuspension</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Calcium phosphate transfection</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Passaging HEK cells</td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td></td><td></td><td>Incubation of mixed population of HEK cells</td></tr><tr><td>UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Image acquisition</td></tr><tr><td>Wide-field microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Image acquisition</td></tr></tbody></table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

Le interazioni proteiche alle interfacce cellulari impongono una moltitudine di risultati biologici che vanno dallo sviluppo dei tessuti e dalla progressione del cancro alla formazione e al mantenimento della sinapsi. Molte di queste interazioni fondamentali si verificano in trans e sono tipicamente indotte da interazioni eterofile o omofile tra cellule che esprimono coppie di legame ancorate a membrana. Chiarire come le mutazioni rilevanti della malattia interrompano queste interazioni proteiche fondamentali può fornire informazioni su una miriade di campi della biologia cellulare. Molti test di interazione proteina-proteina in genere non disambiguano tra cis e interazioni trans, il che potenzialmente porta a una sopravvalutazione dell'estensione di legame che si sta verificando in vivo e comporta una purificazione intensiva del lavoro delle proteine e / o apparecchiature di monitoraggio specializzate. Qui presentiamo un semplice protocollo ottimizzato che consente l'osservazione e la quantificazione di solo interazioni trans senza la necessità di lunghe purificazione proteica o attrezzature specializzate. Il saggio di aggregazione cellulare HEK prevede la miscelazione di due popolazioni indipendenti di cellule HEK, ognuna delle quali esprime ligandi affini legati alla membrana. Dopo un breve periodo di incubazione, i campioni vengono immagine e gli aggregati risultanti vengono quantificati.

La mutazione A687T aumenta Neurexin3α SS4- legando a LRRTM27 Per indagare come le interazioni intercellulari di due proteine sinaptiche note siano influenzate dall'introduzione di una mutazione puntile riscontrata in un paziente con disabilità intellettiva ed epilessia, abbiamo usato il suddetto saggio di aggregazione cellulare HEK (Figura 1). Le cellule sono state trasfette secondo la sezione 1 e preparate per l'imaging secondo le sezioni 1 e 2 del protocollo. Le celle sono state visualizzate nella linea di base in cui non è stata osservata alcuna aggregazione come previsto (non visualizzata). Le immagini acquisite a 60 minuti sono state analizzate come nella sezione 3 del protocollo. Per ridurre al minimo la distorsione della selezione, le condizioni sono state randomizzate per accecare lo sperimentatore. Per motivi simili l'intero campo visivo di ogni immagine è stato selezionato come ROI.
Le condizioni in cui le cellule non esprimevano ligandi sinaptici (GFP/mCherry) mostravano un'aggregazione minima dopo un'incubazione di 60 minuti (Figura 2). Allo stesso modo, le condizioni in cui solo una delle due popolazioni di cellule esprimevano ligandi sinaptici (mCherry/LRRTM2-GFP o GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) presentavano un'aggregazione minima dopo un'incubazione di 60 minuti(figura 2). Come previsto, le condizioni che contenevano due popolazioni di cellule con molecole di adesioni incompatibili (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) non presentavano alcuna aggregazione a 60 minuti(figura 2B). Queste condizioni servivano come controlli negativi critici in quanto LRRTM2 è noto per legarsi esclusivamente a SS4 privo di isoforme (SS4-) di Neurexins ed evidenzia la specificità di questo saggio di aggregazione.
Le condizioni con molecole di adesionecompatibili 8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) hanno mostrato un'aggregazione significativa dopo un'incubazione di 60 minuti (Figura 2C). L'aggregazione può essere visualizzato come gialla ed è presente nella sovrapposizione tra celle (Figura 1 e Figura 2). Sorprendentemente, la condizione in cui Neurexin3α A687T SS4- è stato co-incubato con LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) ha mostrato un'aggregazione significativamente maggiore rispetto alla sua controparte wildtype (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP; controllo positivo). Ciò suggerisce che la mutazione del punto A687T in Neurexin3α migliora le capacità di legame di Neurexin3α SS4- a LRRTM2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61237/61237fig1.jpg"> Figura 1. Flusso di lavoro del test di aggregazione. (A) Le cellule HEK293T vengono trasfette utilizzando una proteina-1/mCherry, o una proteina-2/GFP. (B) Espressione di Neurexin3α prende 48 h. (C) Le cellule vengono raccolte utilizzando EDTA da 10 mM e poi pellettate (D). (E) Le cellule sono mescolate in un rapporto 1:1 e rimescolate in 500 μL di supporti HEK contenenti 10 mM CaCl2 e MgCl2. (F) Le cellule vengono incubate a temperatura ambiente fino a quando non si verifica l'aggregazione e viene acquisita un'immagine finale al 'tempo 60'. L'aggregazione viene visualizzato come il numero di puncta gialli visibili nel campo visivo. Nessuna aggregazione si osserva quando le cellule non esprimono le coppie di ligandi del recettore corrette e sono quindi viste come singole puncta rosse o verdi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61237/61237fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61237/61237fig2.jpg"> Figura 2. Neurexin3αA687T SS4- ha migliorato l'aggregazione con ligando eccitatorio LRRTM2 rispetto a Neurexin3αWT SS4-. (A) Immagini rappresentative dei controlli negativi dopo un'incubazione di 60 minuti di mCherry con GFP, mCherry con LRRTM2, GFP con Neurexin3αWT SS4+/-e GFP con Neurexin3αA687T SS4+/-. L'aggregazione è stata osservata dopo 60 minuti sia in LRRTM2 con Neurexin3αWT SS4-, sia in LRRTM2 con Neurexin3αA687T SS4-. (B) Quantificazione dell'indice di aggregazione in tutte le condizioni SS4+ dopo 60 minuti. Indice di aggregazione = area di sovrapposizione/(area del canale 1 + area del canale 2 – area di sovrapposizione) x 100. (C) Uguale a (B) ma SS4-. I dati mostrati rappresentano la media ± SEM del numero di esperimenti (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). I numeri presentati nelle barre rappresentano il numero di esperimenti indipendenti effettuati. Le linee tratteggiate rappresentano l'aggregazione minima di base o media delle condizioni di controllo. La significatività statistica è stata determinata da ANOVA uni-way, confronti multipli; *p<0,05; p<0.0001.Questa cifra è stata modificata da Restrepo etal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61237/61237fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File di codifica supplementari. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61237/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questi file.</a>

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Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.4K Views.  University of Colorado Denver School of Medicine. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Video: Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Ricerca

Biochimica

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Bioingegneria

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble effectively in vitro. Such complexes may require co-translational assembly and the presence of molecular chaperones; either they form stable oligomers which cannot dissociate and re-associate in vitro or are unstable without a binding partner. To overcome these problems, it is possible to use a method based on the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors followed by the conventional pulldown techniques. The workflow is more time-efficient compared to traditional pulldown because it lacks the time-consuming steps of separate purification of interacting proteins and their following incubation. Another advantage is a higher reproducibility due to a significantly smaller number of steps and a shorter period of time in which proteins that exist within the in vitro environment are exposed to proteolysis and oxidation. The method was successfully applied for studying a number of protein-protein interactions when other in vitro techniques were found to be unsuitable. The method can be used for batch testing protein-protein interactions. Representative results are shown for studies of interactions between BTB domain and intrinsically disordered proteins, and of heterodimers of zinc-finger-associated domains.

Here, we describe a method for the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors, followed by the conventional pulldown techniques to study protein complexes that cannot assemble in vitro.

Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biologia

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Quantificazione delle interazioni proteiche basata sull'imaging di singole molecole su cellule vive

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Autore in primo piano: Valutazione della dinamica proteina-condensato in cellule umane vive

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans

Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

Approcci genetici e biochimici per

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari