Questo protocollo riduce la complessità tecnica e il tempo necessario per l'arricchimento di vescicole extracellulari da Mycobacterium tuberculosis, EV Mtb. Fornisce un'alternativa delicata alle tradizionali tecniche di ultracentrifugazione e basate sulla densità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da eseguire, rendendola più riproducibile.
Fornisce un'alta resa di EV Mtb con un minimo co-arricchimento proteico non-EV. A dimostrare la procedura sarà Joanie Ryan, ex studentessa laureata del nostro laboratorio. Per iniziare, preparare un filtro centrifugo di taglio del peso molecolare da 100 kilodalton aggiungendo l'intera capacità volumetrica di PBS.
Centrifugare per cinque minuti a 2.800 volte G a 4 gradi Celsius. Scartare il flowthrough e qualsiasi PBS rimanente e riempire la camera di campionamento con Mtb CFP alla sua capacità massima. Centrifugare a 2.800 volte G a 4 gradi Celsius fino a quando il volume si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione.
Se necessario, ripetere fino a quando l'intero campione non sia stato sufficientemente ridotto. Aggiungere 1X PBS all'unità filtrante contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto in precedenza e ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e lo scambio di tampone.
Quindi, recuperare il retentato CFP concentrato da 100 kilodalton o 100R, secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione. Lavare il filtro con un volume minimo di 1X PBS almeno tre volte e tirare il lavaggio con 100R per massimizzare il recupero. Utilizzare diverse diluizioni di campioni in PBS e quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninic.
Testare il campione in triplice copia. Consentire la cromatografia di esclusione dimensionale, o colonna SEC, per equilibrare a temperatura ambiente. Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità tower e, se necessario, premere Setup sul touch screen del menu principale per regolare le impostazioni della cella di carico.
Dalla schermata di configurazione, allineare il carosello selezionando Carousel seguito da Calibrate. Inserire il carosello con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare il carosello premendo i pulsanti meno o più in modo che l'ugello del fluido sia direttamente sopra la posizione di lavaggio. Rimuovere i tappi dalla colonna SEC equilibrata e far scorrere la colonna SEC nel supporto della colonna appropriato.
Installarlo con cura sulla torre AFC. Assicurarsi che l'etichetta di identificazione a radiofrequenza sulla colonna sia rivolta verso l'AFC e verificare che il collegamento tra la colonna e la valvola sia sicuro. Posizionare il tubo di scarico dei rifiuti in un contenitore di raccolta.
Dalla schermata di configurazione, selezionare Programma di raccolta e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0,5 millilitri premendo i pulsanti meno o più. Lasciare l'impostazione del volume del buffer come predefinita di 2,7 millilitri, quindi chiudere la finestra di pianificazione della raccolta. Selezionare Avvia raccolta dalla schermata iniziale e confermare i parametri di raccolta selezionando Sì.
Carico 13 tubi di microcentrifuga etichettati da 1,7 millilitri con i coperchi aperti e rivolti verso il centro della giostra. Avanzare l'AFC selezionando OK, quindi montare il serbatoio della colonna e avanzare di nuovo premendo OK. Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo Sì e aggiungere un volume di colonna di PBS filtrato a 0,2 micrometri per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il flush (AFC), far avanzare l'AFC premendo OK. Posizionare il coperchio del carosello sull'AFC e premere OK. Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali buffer in eccesso dalla colonna.
Portare tre milligrammi di campione 100R a 500 microlitri con 1X PBS e aggiungere il campione nella parte superiore della colonna. Preparare un volume di colonna di PBS filtrato a 0,2 micrometri. Far avanzare l'AFC e lasciare che il campione si svolga nel tastio.
Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato in precedenza al serbatoio. Monitorare l'esecuzione dell'AFC mentre raccoglie prima il volume vuoto e quindi le frazioni specificate. Al termine della corsa e la giostra ritorna nella posizione di scarico, rimuovere il coperchio e i tubi di frazione dal carosello.
Per frazioni di 0,5 millimetri raccolte da tre milligrammi di CFP 100R Mtb, misurare la concentrazione proteica utilizzando il micro-BCA con una diluizione 1:3 per le frazioni numerate da 1 a 7 di ciascun campione in triplice copia. Per frazioni da 0,5 millilitri numerate da 5 a 13, utilizzare il BCA senza diluizione per ciascun campione in triplice copia. Aggiungere tampone campione SDS a 10 microlitri di ciascuna frazione e cinque microgrammi di CFP e 100R.
Far bollire per cinque minuti a 100 gradi Celsius. Quindi caricare su un gel Bis-Tris dal 4 al 12% con una scala a peso molecolare per elettroforesi su gel di poliacrilammide o PAGE. Eseguire un gel SDS-PAGE utilizzando un buffer MES 1X e una corrente di 200 volt per 35 minuti.
Rimuovere il gel dalla cassetta e applicare una corrente di 50 volt per un minimo di un'ora per trasferire le proteine risolte su una membrana nitrocellulosa di 0,2 micrometri. Infine, eseguire l'analisi Western blot per valutare le proteine. Un gel SDS-PAGE colorato con argento dimostra il profilo proteico complessivo per ogni frazione.
I dati mostrano che le frazioni successive contengono più proteine e assomigliano al materiale 100R. I Western blot che rilevano LAM, LpqH e GroES dimostrano che i marcatori proteici cambiano tra le frazioni. Qui sono mostrate la microscopia elettronica a trasmissione, o immagini TEM, delle frazioni SEC da 1 a 3 tirate prima della fissazione.
L'ultracentrifugazione del gradiente di densità dei veicoli elettrici Mtb è stata colorata negativamente per l'imaging TEM. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, o distribuzione NTA, delle frazioni SEC da 1 a 3 è mostrata qui. I veicoli elettrici Mtb a ultracentrifugazione a gradiente di densità sono stati analizzati con analisi di tracciamento delle nanoparticelle e la distribuzione delle dimensioni è visualizzata qui.
Questo protocollo è stato ottimizzato per la purificazione EV da tre milligrammi di 100R. Se il carico proteico è variato, la diluizione raccomandata e la strategia BCA sulle frazioni risultanti possono richiedere aggiustamenti. I veicoli elettrici Mtb preparati con questa tecnica possono essere utilizzati per studi composizionali e omici a valle.
Sono adatti anche per esperimenti in vitro e in vivo. Questa tecnica fornisce un modo semplice ed efficiente per produrre preparati EV Mtb di alta qualità, aprendo la strada a una maggiore riproducibilità nei futuri esperimenti di EV Mtb.
