Dimostriamo innumerevoli metodi per tutto il controllo ottico e l'osservazione dell'attività cellulare innescata nei cardiomiociti derivati da iPSC per lo screening farmacologico ad alto rendimento e il test di tossicità. Consentire la quantificazione multiparametrica dei modelli fenotipici nel tempo e nello spazio, consentire l'osservazione dell'effetto dei farmaci per ore o giorni. Questo metodo può essere applicato a diversi tipi di cellule, come neuros o cellule beta, per lo screening funzionale e il test di tossicità.
A dimostrare la procedura sarà Wan-Chi Su, un ingegnere di bio-imaging del mio laboratorio. Preparare la piastra multipozzetto prima che i cardiomiociti iPSC vengano rimossi dalla conservazione a freddo per lo scongelamento. Rivestire ogni pozzetto della micro piastra da 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione di gelatina allo 0,02% con 50 microgrammi per millilitro di fibronectina per coprire accuratamente tutte le superfici.
Trasferire i cardiomiociti iPSC dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto liquido a un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Portare la fiala in un armadietto di biosicurezza di classe due e trasferire delicatamente il contenuto in un nuovo tubo conico da 15 millilitri contenente nove millilitri di mezzo a temperatura ambiente. Centrifugare le celle a 200 volte G per tre minuti a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante mediante pipetta e risospendere delicatamente le cellule in un millilitro di terreno con 10 micromolari inibitori ROCK Y27632. Le celle a piastre rivestivano 96 piastre di pozzetti alla densità da 100.000 a 150.000 celle per centimetro quadrato, secondo le istruzioni del produttore. Dopo 24 ore, assicurarsi che le cellule attaccate alla superficie della piastra siano in contatto con altre cellule.
Dopo aver placcato le cellule per 72 ore scongelare i kit virali GECI sul ghiaccio. Preparare una soluzione madre virale a doppia resistenza con il mezzo di mantenimento. Preparare le cellule per l'infezione regolando il volume medio a 100 microlitri per pozzetto.
Aggiungere 100 microlitri della soluzione virale premiscelata ai pozzetti e incubare per otto a 16 ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sostituire con 200 microlitri di mezzo preriscaldato. Visualizza l'espressione dei GECI 24 ore dopo la trasduzione utilizzando un sistema di imaging.
Mantenere le cellule nell'incubatore umidificato prima che vengano eseguiti i saggi funzionali. Accendi tutti i dispositivi del sistema di imaging ad alto contenuto. Verificare che la temperatura della camera raggiunga i 37 gradi Celsius con un'integrazione di anidride carbonica del 5%.
Aprire il software di imaging e scegliere l'impostazione della piastra per una piastra a 96 pozzetti. Posizionare una piastra a 96 pozzetti senza coperchio nella camera e caricare l'anello di tenuta della cella sotto tensione sulla parte superiore. Scegli l'obiettivo ad immersione in acqua 20X, 60X e 20X, in base alla risoluzione spaziale richiesta.
Regolare la messa a fuoco per scattare immagini nitide prima dell'acquisizione sperimentale. Selezionare da tre a cinque regioni in modo casuale per pozzetto per la registrazione dell'attività del calcio. Scegli filtri appropriati per diversi indicatori.
Impostare la potenza del diodo a emissione luminosa appropriata per ciascun canale di imaging utilizzato. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera su un massimo di 40 millisecondi o 25 hertz e una durata di registrazione di 30 secondi per l'acquisizione del flusso per osservare i transitori di calcio, riportati dalle sonde MNG-GECO e K-GECO espressi nei cardiomiociti. Aumentare la potenza del LED se il rapporto segnale/rumore è inferiore a due a frame rate più elevati.
Per la stimolazione optogenetica, ottimizzare la potenza e la frequenza della luce blu a un hertz e avviare l'acquisizione. Risospendere E4031 Dofetilide e Verapamil in DMSO e diluirli con il tampone Tyrode. Disporre bene i composti sul bersaglio corrispondente.
Aggiungere 100 microlitri del composto a doppia resistenza tramite il sistema microfluidico automatico nei pozzetti e iniziare l'acquisizione dopo il periodo di incubazione desiderato. Isolare l'area del segnale dallo sfondo rilevando automaticamente la funzione degli impulsi, nel tempo di risoluzione, con il software. Utilizzare il software di analisi del picco di calcio per analizzare la frequenza di battimento, il segnale di picco, la durata transitoria del calcio 50% durata transitoria del calcio 90% tempo di salita e il tempo di decadimento.
L'osservazione dell'oscillazione spontanea del calcio in NMG-GECO espressa da cardiomiociti derivati da iPSC con o senza trattamenti farmacologici è dimostrata nel video. Le tracce cinetiche ottenute utilizzando MNG-GECO hanno mostrato che i piccoli inibitori dei canali molecolari ionici Verapamil, Dofetilide ed E4031 hanno influenzato i transitori di calcio come previsto. Per valutare la risposta alla dose di E4031 in condizioni standardizzate e stimolate, la canalerodepsina-2 e K-GECO che esprimono iPSC CM sono state controllate otticamente utilizzando impulsi di luce a un hertz e 470 nanometri e osservate utilizzando il segnale rosso K-GECO.
Riduzioni progressive dell'ampiezza del picco e aumento del tempo di decadimento dei transitori di calcio si verificano con concentrazioni crescenti di E4031. Un effetto dose-dipendente di E4031 è stato più evidente per le riduzioni dell'ampiezza del picco. I transitori di calcio chiari rimangono visibili un mese dopo la trasduzione virale o senza la luce aggiuntiva utilizzata per la stimolazione ottica.
Il grafico raffigura un farmaco che sembra aumentare la frequenza di battito, regolarizzare l'intervallo di contrazione e aumentare l'ampiezza transitoria del calcio, nella modalità LVNC iPSC CM. Anche la variabilità della frequenza del battito e il conseguente impatto sulla durata dei transitori di calcio cambiano man mano che le CM iPSC vengono mantenute in coltura. Diversi GECI, tra cui ER LAR-GECO, MTG-Seppia, e NIR-GECO, sono stati sviluppati per l'espressione singolarmente o in combinazione in modelli cellulari per la misurazione in tempo reale dell'attività del calcio che si manifesta rispettivamente nel reticolo endoplasmatico, nel reticolo sarcoplasmatico, nei mitocondri e nel citosol.
I GECI possono essere combinati nel modello iPSC CM per studiare diverse riserve intracellulari di calcio. I cardiomiociti espressi da K-GECO hanno mostrato un comportamento di battitura costante nel tempo. Tuttavia, il caricamento di Fluo-4 ha influenzato sia la frequenza di battimento che la CTD in questo modello, suggerendo che Fluo-4, di per sé, potrebbe influenzare i risultati di tali esperimenti.
Offriamo un modo semplice per studiare i profili fenotipici da cellule di controllo e derivate dal paziente, mentre l'intermedio iPSC può far luce sulla scoperta di farmaci in varie malattie.
