Il seguente protocollo descrive lo sviluppo di reti di cardiomiociti pluripotenti derivati da cellule staminali indotte dall'uomo su piastre MEA multiwell per elettroporare reversibilmente le membrane cellulari per misurazioni potenziali d'azione. I parametri del potenziale d'azione possono quindi essere utilizzati per generare tali curve di risposta per testare i composti per l'elettrofisiologia. La codifica MEA multiwell e la placcatura cellulare sono i passaggi più impegnativi che necessitano di particolare attenzione.
È necessario eseguire questi passaggi diligentemente e rapidamente per evitare che le goccioline si diffondano e si asciughino. Con la pratica, questo può essere facilmente superato. Abbiamo sviluppato un'interfaccia utente grafica personalizzata per la segmentazione singola, la garanzia della qualità e l'estrazione dei parametri.
Il nostro robusto flusso di lavoro MATLAB è stato implementato per ridurre rapidamente grandi volumi di dati sperimentali grezzi in un raggruppamento imparziale di potenziali forme d'onda d'azione. Inizia scongelando cardiomiociti pluripotenti derivati da cellule staminali indotte dall'uomo secondo le indicazioni manoscritte. Sospendere delicatamente le celle utilizzando una pipetta di trasferimento per dissociare i grumi cellulari.
Quindi erogare con cura due millilitri di sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra a sei pozzi rivestita di substrato e posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Le cellule devono aderire alle vie gel di 24 ore e battere spontaneamente a 48 ore dopo la placcatura. Due giorni prima della placcatura aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di coltura di cardiomiociti iPSC umani a ciascun pozzo di un array multi-elettrodo da 24 pozzetti, o piastra MEA, ed eseguire una registrazione di base per verificare il rapporto segnale-rumore come controllo di qualità dei MEA.
Quindi, aspirare il supporto, sciacquare i pozzi con acqua sterile e sterilizzare sotto una luce UV in un cappuccio di flusso laminare durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere 0,1 millilitro di FBS ad ogni pozzo per il trattamento idrofilo delle superfici MEA e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi aspirare l'FBS e risciacquare ogni bene due volte con 0,5 millilitri di acqua sterile.
Lasciare asciugare la piastra nella cappa di flusso laminare durante la notte. Il giorno seguente, pipettare cinque microlitri di diluizione della fibronectina funzionante e erogare con cura la goccia al centro di ogni pozzo per coprire tutti i 12 elettrodi. Posizionare immediatamente la piastra su una superficie rialzata all'interno di una camera umidificante contenente abbastanza acqua sterile per coprire l'intera superficie del piatto.
Posizionare la camera con la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per tre ore e quindi procedere con la placcatura cellulare. Quando sei pronto a placcare i cardiomiociti, regola la densità cellulare a 6.000 cellule per microlitro diluendoli nel mezzo di scongelamento dei cardiomiociti iPSC umani. Utilizzare un tocco delicato per evitare che le cellule si sedimentino.
Portare la piastra MEA nella cappa di flusso laminare e rimuovere con cura la caduta di fibronectina con una pipetta P10 senza toccare gli elettrodi. Erogare immediatamente una goccioline a cinque microliter al centro del pozzo assicurandosi di coprire tutti i 12 elettrodi. Fare questo bene alla volta per evitare che la fibronectina si asciughi.
Al termine della placcatura, riposizionare la piastra MEA nella camera umidificante liberamente coperta e restituirla all'incubatore di coltura cellulare per tre ore. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta P200 per aggiungere con cura 200 microlitri di cardiomiocita iPSC umano scongelando il mezzo ad ogni pozzo senza disturbare le cellule. Riposizionare la piastra MEA nell'incubatore di coltura cellulare e sostituire il mezzo di coltura 24 ore dopo la placcatura.
Quando sei pronto ad acquisire il segnale dai cardiomiociti, avvia il software di acquisizione e inserisci la piastra MEA secondo le indicazioni manoscritte. Fare clic sul pulsante Esplora per visualizzare il segnale in tutti i pozzi e verificare la qualità del segnale in condizioni di stato stazionario. Prendere appunti sugli elettrodi con potenziale di campo, o FP, segnali nell'intervallo millivolt.
Quindi fai clic sullo stesso pulsante per interrompere l'esplorazione. Finora non sono stati registrati dati. Fare clic sul pulsante Vai per avviare la registrazione.
Gli elettrodi in ogni pozzo mostreranno segnali FP nella finestra dei dati grezzi. Dopo 30 secondi di registrazione, fare clic sul pulsante Stimola e consentire l'elettroporazione sui siti selezionati per 30 secondi. Quindi fai clic sullo stesso pulsante per interrompere la simulazione e continuare la registrazione per 60 secondi.
Utilizzare il software personalizzato basato su MATLAB per segmentare ed estrarre vari potenziali parametri di dati di potenziale campo e azione. Eseguire innanzitutto il codice di analisi della forma d'onda, quindi fare clic su File e selezionare Process.h5. Trovare e selezionare il mwd creato in precedenza.
h5. Fare clic sul pulsante Salva directory per modificare il percorso di archiviazione dei file di output. Quindi creare una coda di elaborazione del segnale selezionando l'elettrodo e le combinazioni di pozzi di interesse e quindi facendo clic sul pulsante Coda.
Ripetere questo passaggio per aggiungere più elettrodi e combinazioni di pozzi alla coda. Se le cellule sono state trattate con farmaci, la coda può essere modificata cliccando direttamente su Med Name, Med Concentration. Una volta finalizzata la coda, fare clic sul pulsante Inizializza forme d'onda, che avvia l'elaborazione preliminare in cui i segnali vengono identificati ed estratti per la segmentazione.
Al termine dell'elaborazione, fare clic sul pulsante Zoom avanti e selezionare il potenziale di azione, o PUNTO di accesso, area di interesse. Fare clic sul pulsante Mantieni e rivedere i pannelli. I picchi e i trogoli vengono rilevati per ogni forma d'onda e gli AP normalizzati sono sovrapposti.
Al termine, fare clic sul pulsante Mantieni per passare alla traccia successiva nella coda e ripetere il processo per il resto dell'elettrodo e i segnali di combinazione dei pozzi. La vitalità e la densità di placcatura dei cardiomiociti post-scongelati è fondamentale per la cultura MEA multiwell. Una corretta placcatura si traduce in una sana coltura monostrato con battitura spontanea a 48 ore, mentre la scarsa vitalità cellulare si traduce in colture con un'alta percentuale di popolazioni non miocite.
La dispersione delle goccioline cellulari influisce sulla densità di coltura e può persino portare alla morte cellulare, quindi il posizionamento preciso delle cellule è importante. Le celle coltivate su MEA sono sottoposte a un controllo di qualità per l'attività elettrica 48 ore dopo la placcatura. Se il 50% degli elettrodi all'interno di una rete e il 70% delle reti totali non producono segnali FP, allora la coltura è non ottimale.
Le registrazioni AP mediate dall'elettroporazione possono essere ottenute più volte 48 ore dopo la placcatura MEA. Le elettroporazioni multiple dello stesso sito cellulare a zero, 24, 48, 72 e 96 ore non hanno alcun effetto significativo sulla forma AP nel tempo. Inoltre, non è stata osservata alcuna correlazione tra le ampiezze AP fp e post elettroporazione dallo stesso sito cellulare.
Un vantaggio significativo di questo metodo è che la piastra MEA multiwell può essere riutilizzata più volte. Per dimostrare l'affidabilità di questo array, le forme d'onda 3, 815 AP vengono estratte da tre batch di ripristino e vengono estratti i dati sulla durata del punto di accesso per esaminare la ripetibilità dei risultati. Quando di interesse, è possibile eseguire test aggiuntivi, come l'espressione genica, misurazioni transitorie del calcio e patch clamp per indagare il comportamento di specifiche correnti ioniche.
Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per migliorare la maturazione elettrofisiologia e per schermare gli effetti della dose cronica sui cardiomiociti.
