Questa tecnica è più affidabile ed efficiente e non richiede una pratica o un addestramento approfonditi rispetto alle tecniche di apparecchi Langendorff più comunemente usate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che limita il tempo ischemico poiché la perfusione iniziale avviene in vivo. Durante l'esecuzione di questa tecnica, è essenziale evitare bolle nel collettore e per evitare un eccessivo movimento del cuore durante la digestione, queste possono diminuire la resa.
A dimostrare questa tecnica sarà Sarah Sturgill, una studentessa laureata nel laboratorio del Dr.Mark Ziolo. Iniziare con la pulizia del collettore a temperatura controllata utilizzando un tampone di perfusione appena preparato. Per fare ciò, avvitare un ago calibro 27 e rimuovere le bolle utilizzando un connettore luer lock.
Assicurati che non rimangano bolle. Per isolare il cardiomiocita, esporre lo sterno del topo completamente anestetizzato, e lateralmente alla linea mediana, tagliare prossimalmente attraverso le costole e all'ascella. Quindi tagliare attraverso il diaframma, assicurando tagli superficiali per evitare il cuore.
Bloccare lo sterno con un emostatico e piegare le costole all'indietro per esporre la cavità toracica. Rimuovere delicatamente il pericardio dal cuore prima di tagliare la vena cava inferiore immediatamente distale al cuore. Iniettare tre millilitri di tampone ghiacciato nel ventricolo destro del cuore in un minuto utilizzando un ago da 27 gauge.
Quindi, tieni il cuore usando una pinzetta. Tirarlo via dal corpo ed esporre il più possibile l'aorta. Quindi bloccare l'aorta ascendente usando un emostato e asportare il cuore.
Trasferire rapidamente il cuore bloccato sul coperchio di una capsula di Petri in polipropilene contenente 10 millilitri di tampone di perfusione calda. Posizionare il cuore bloccato nella piattaforma di supporto e iniettare 10 millilitri di tampone di perfusione a temperatura controllata a 37 gradi Celsius nel ventricolo sinistro per cinque minuti utilizzando un ago stabilizzato da 27 gauge collegato al collettore. Quindi, trasferire il cuore bloccato e la piattaforma di supporto in una capsula di Petri con circa cinque millilitri di tampone di digestione.
Sostituire le siringhe di ingresso con una siringa da 50 millilitri contenente 25 millilitri di tampone di digestione. Eliminare il collettore da eventuali bolle e il tampone di perfusione rimanente prima dell'iniezione. Riposizionare con cautela l'ago nella stessa posizione dell'ago nell'apice ventricolare sinistro.
Con l'aiuto di una pompa di perfusione, iniettare tampone di digestione a 37 gradi Celsius nel ventricolo sinistro per 15 minuti utilizzando una siringa da 50 millilitri. Controllare la temperatura della soluzione con una camicia d'acqua calibrata per espellere la soluzione a 37 gradi Celsius. Rimuovere i ventricoli dagli atri prima di trasferirli in un becher da 10 millilitri.
Aggiungere tre millilitri di tampone di digestione al becher e tagliare i ventricoli in grandi pezzi usando forbici affilate. Coprire il becher con un foglio di alluminio e metterlo in un bagno d'acqua agitante preriscaldato a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere i pezzi di tessuto in tre millilitri di tampone digestivo e triturarlo per circa quattro minuti o fino a raggiungere una miscela omogenea.
Una volta fatto, filtrare le celle in un tubo di polipropilene da 50 millilitri utilizzando un filtro di nylon da 70 micrometri. Lavare il filtro cellulare in nylon con tre millilitri di tampone digestivo. Riportare il filtrato in un tubo di polipropilene con fondo rotondo da 14 millilitri e centrifugarlo.
Scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in tre millilitri di tampone di arresto. Alla sospensione cellulare, aggiungere 54 microlitri di 100 millimolari di calcio cloruro di calcio per rendere la concentrazione finale di cloruro di calcio 1,8 millimolare. Lasciare riposare le cellule vive per 10 minuti e rimuovere il surnatante contenente cellule morte.
Dopo aver risospeso il pellet in una soluzione di stoccaggio, le cellule possono essere utilizzate per esperimenti funzionali e colture. Le immagini al microscopio a campo chiaro di cellule isolate hanno mostrato che l'isolamento dei cardiomiociti di topo produceva cellule quiescenti a forma di bastoncello senza macchie di membrana o bordi arrotondati. Le cellule hanno mostrato una resa di circa l'80% e alti tassi di sopravvivenza che hanno determinato il successo della tecnica di isolamento.
Per un isolamento di successo, è molto importante rimuovere le bolle dal collettore e inserire l'ago nello stesso foro nel cuore. Una volta isolati, i cardiomiociti possono essere utilizzati per esperimenti funzionali cellulari e molecolari.
