Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, Lung, and Blood Institute di Grant HL-36573. Ringraziamo il Sig. David Sowa per la modifica di questo manoscritto.

Tutte le ricerche sui topi è stato fatto secondo le procedure e le linee guida del National Institutes of Health, e i protocolli sono stati approvati dal Comitato delle Università di Toledo Istituzionale cura degli animali ed uso, Collegio di Medicina e Scienze della Vita. 1. Perfusione preparazione sistema <ol><li> Il giorno prima isolamento, riempire l&#39;intero sistema di perfusione (compresi serbatoi) con una soluzione di detersivo veloce senza residui alcalini. Lasciare che la soluzione di penetrare nel sistema per poche ore o durante la notte. </li><li> La mattina successiva, regolare la temperatura termociclatore a 37 ° C e lasciare la soluzione di scaldarsi. Rimuovere la soluzione detergente e lavare accuratamente il sistema con acqua distillata sterilizzata. Non dimenticare tutti i rami laterali. </li><li> Riempire il sistema con tampone di perfusione attraverso una pompa peristaltica costante e disegnare le bollicine d&#39;aria dalla camera aorta (gorgogliatore) con una siringa laterale per proteggereil cuore da occlusione coronarica. La portata della pompa peristaltica deve essere controllato regolarmente. </li></ol> 2. Preparazione del buffer, Cultura Media e Piatti <ol><li> Perfusione Buffer: Fai 500 ml di tampone di perfusione 1x prima dell&#39;uso. Questo buffer priva di calcio contiene 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0.6 mM Na 2 HPO 4, 1.2 MgSO mm 4, 10 mM Na-HEPES, 12 NaHCO mm 3, 10 KHCO mm 3, 0.032 fenolo mm Rosso, taurina 30 mm, BDM 10 mm, 5,5 mM di glucosio. Regolare il pH a 7.0 con 2 M HCl e filtrare attraverso un filtro di 0,2 micron, conservare a 4 ° C. Nota: a) La soluzione perfusione deve essere preparata nello stesso giorno in cui viene utilizzato. In alcuni casi, è accettabile per conservare la soluzione per meno di 3 giorni a 4 ° C. b) Questo buffer ha una concentrazione di potassio alti fino a 15,3 millimetri, che può mantenere i cardiomiociti riposo, ridurre ATP cONSUMO e aumentare la capacità di Ca 2 +-tolerant. </li><li> Digestion Buffer (300 U / ml, 25-50 ml / cuore): preparare appena prima di perfusione. Pesare 15.000 U di attività totale di tipo II collagenasi, sciogliere in 50 ml di tampone di perfusione in cappa di coltura. Aggiungere 25 ml di 100 mM CaCl 2 (soluzione, filtra sterilizzato) per rendere la concentrazione finale di calcio a 50 micron. Riscaldare il buffer di 37 ° C quando è pronto per l&#39;isolamento. Diversamente tripsina, collagenasi funziona meglio in presenza di 50-100 mM Ca 2 +. </li><li> Arresto Buffer (50 ml / cuore): Operare in cappa di coltura. Miscelare 45 ml di tampone di perfusione con 5 ml sterile FBS. <ol><li> Ca 2 + soluzione I (12.5 mM Ca 2 +): Aggiungere 2,5 ml di 100 mM CaCl 2 a 20 ml di tampone di arresto e mescolare. </li><li> Ca 2 + soluzione II (100 mM Ca 2 +): Aggiungere 10 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare. </li><li> Ca 2 + soluzione III (400 mM Ca 2 +): Aggiungere 40 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare. </li><li> Ca 2 + IV soluzione (900 mM Ca 2 +): Aggiungere 90 ml di 100 mM CaCl 2 a 10 ml di tampone di arresto e mescolare. </li></ol></li><li> Placcatura medio (50 ml / cuore): Trasferimento 43 ml di MEM contenente 2 mM L-glutammina e 1.26 mM CaCl 2 in una sterile tubo conico da 50 ml in cappa di coltura e aggiungere 5 ml di FBS, 1 ml di soluzione BDM ( 500 mM, sterilizzato per filtrazione), e 0,5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml). Mescolare ed equilibrare per 2-3 ore prima dell&#39;isolamento miociti in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore con i tappi allentati. Proprio prima placcatura miociti, aggiungere 0,5 ml di ATP 200 mM (pH 7.2, soluzione madre, filtra sterilizzato) nel mezzo. </li><li> Terreno di coltura (50 ml / heart): Trasferimento 48 ml di MEM contenente 2 mM L-glutammina e 1.26 mM CaCl 2 in una sterile tubo conico da 50 ml in cappa di coltura e aggiungere 1 ml di soluzione madre BDM (500 mm, filter sterilizzato), e 0,5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml). Mescolare ed equilibrare in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore prima dell&#39;isolamento miociti. Prima dell&#39;uso, aggiungere 0,5 ml di 100 mg / ml di BSA (filtro sterilizzato) nel mezzo. Nota: L&#39;utilizzo di un incubatore CO 2 2% facilita il mantenimento della cultura medio pH a 6,9-7,0, che aiuta i myoctyes mantengono la loro morfologia a forma di bastoncello fino a 24 ore. </li><li> Laminina (1-2 mg / cm 2) piatti rivestiti o piastre: Trasferire 200 microlitri di 1 mg / ml topo naturale laminina a 20 ml di PBS sterile (w / o calcio e magnesio) e mescolare. Aggiungere 1 ml di piatti da 35 mm, 2,5 ml di piatti da 60 mm, o 5 ml di piatti da 100 mm, agitare per coprire uniformemente le superfici, e il luogo in 2% di CO 2, 37 ° C incubatore fino placcatura miociti. Nota: Se le stoviglie o piastre non vengono utilizzati il giorno rivestito, possono essere sigillati con parafilm e conservati a 4 ° C per una notte (Coating Lento). Tenuta è required per evitare l&#39;evaporazione e la contaminazione. Piastre rivestite possono essere conservati a 4 ° C per 1 settimana. </li></ol> 3. Rimozione del mouse Cuore e Incannulamento <ol><li> Immergere le forbici e pinze nel 70% di etanolo per 30 minuti e lasciare asciugare. </li><li> Pesare il mouse con un&#39;approssimazione di 0,1 grammi. Registrare il suo peso corporeo, ceppo e sesso, e data di nascita. </li><li> Iniettare 200 ml di eparina (100 UI / mouse) ip 10 min prima dell&#39;anestesia per evitare la coagulazione del sangue nelle arterie coronarie. Anestetizzare il mouse con 200 mg / kg di peso corporeo di ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo di xylazina per iniezione ip e attendere per 5-10 minuti fino a quando il mouse non risponde a pizzichi coda / punta. </li><li> Fissare il mouse nella posizione supina fissando delicatamente le zampe anteriori e hindpaws per una superficie di lavoro Pinnable (ad esempio polistirolo) su un vassoio chirurgico animale o panca tavolo vicino al sistema di perfusione. </li><li> Pulire il torace e l&#39;addome con il 70% di etanolo. Fai una pelle i linea medianancision da metà addome al diaframma con una forbice chirurgica. </li><li> Tagliare il diaframma con un altro forbice chirurgica e tenere lo sterno con le pinze dentate curve. Tagliare bilaterale e retroflect gabbia toracica per esporre il cuore. </li><li> Sollevare cuore leggermente utilizzando pinza sottile seghettati e atraumatica curvi e sezionare il cuore fuori della cavità toracica più vicino possibile alla parete toracica dorsale. </li><li> Trasferire il cuore ad un piatto da 100 mm contenente tampone perfusione fredda. Rifilare con cura via i tessuti connettivi come i polmoni, timo, e bronchi. </li><li> Identificare l&#39;aorta e le sue diramazioni del cranio, che di solito sono nascosti da timo e cuscinetto adiposo. Tagliare l&#39;aorta sotto del suo primo ramo 13, afferrare la parete aortica, alzare il cuore, e leggermente scivolare al perfusione cannula aortica pieno di liquido (1,0 mm di diametro cannula in acciaio inox con punta smussata / piatta e tacche 1 e 2 mm dal la punta, o un 22 G alimentazione riutilizzabile ago) utilizzando due ultra fine-tip forceps. Nota: a) Il liquido di perfusione deve essere gocciolamenti durante incannulazione cardiaca per evitare bolle di gas di entrare arterie coronarie; b) Mantenere la punta della cannula appena sopra la valvola aortica. </li><li> Bloccare l&#39;aorta alla cannula e legare l&#39;aorta alla cannula con 6-0 seta chirurgica. L&#39;intero incannulamento dovrebbe prendere meno di 120 sec. </li></ol> 4. Cuore di Perfusione e digestione <ol><li> Profumato cuore con tampone di perfusione privo di calcio a portata di 4 ml / min circa 4-5 minuti fino a quando gli effluenti diventano chiari, quindi passare al buffer di digestione contenente 50 mM CaCl 2 e profumato per 3,5-20 min a seconda del ceppo di topi, pressione di perfusione e l&#39;attività collagenasi. Se del caso, aumentare la pressione aorta di 70-80 mmHg durante la digestione. Quando necessario, enzima perfusato può essere ricircolata per la digestione. Tipicamente, 300 tampone U / ml enzima digerire un cuore in 10-12 min ad una velocità di flusso di 4 ml / min;Se applicando pressione post-carico a 70 mmHg, 300 U / ml impiegheranno solo 3.5-5.5 min ad una velocità di flusso di 4 ml / min. </li><li> Fermare la digestione quando il cuore diventa leggermente pallido e flaccido. Dovrebbe essere spugnoso quando pizzicato delicatamente. </li></ol> 5. Celle di dissociazione e Calcio reintroduzione <ol><li> Estrarre l&#39;aorta dalla cannula con il 70% pinza etanolo-bagnato e mettere il cuore in un piatto sterile di 60 mm contenente 2,5 ml di tampone di digestione. Spostatevi nella cappa coltura utilizzando materiali sterili, rimanendo consapevoli delle tecniche sterili per questo e gradini di follow-up. </li><li> Rimuovere aorta, atri, e dei grossi vasi con belle forbici chirurgiche. Stuzzicare delicatamente il ventricolo in 10-12 piccoli pezzi con due pinze fine-tip. </li><li> Pipettare delicatamente i pezzi del cuore e le cellule su e giù ~ 10x con una pipetta di trasferimento da 10 ml e poi trasferire in un tubo di polipropilene conica da 15 ml. Sciacquare il piatto con 7,5 ml di soluzione di calcio che contenga 12,5 mM CaCl 2 e il trasferimentoquesto nel tubo, risultante in un volume finale di 10 ml. </li><li> Pipetta delicatamente la sospensione cellulare su e giù con una pipetta fine-tip per disperdere i grandi pezzi di tessuto cardiaco. </li><li> Centrifugare per 3 minuti a 20 xg per separare piccole cellule non miociti quali cellule endoteliali e fibroblasti. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet miociti in 10 ml di soluzione di calcio che con un supplemento di 100 ml di ATP 200 mM (pH 7.2, soluzione madre, filtra sterilizzato). Lasciare il tubo nel cappuccio per 3-5 min. </li><li> Trasferimento duplicare 10 microlitri aliquote ad un emocitometro per contare miociti e rotondo a forma di asta. Calcolare il numero totale di miociti e calcolare la percentuale di miociti astiformi. </li><li> Centrifugare i miociti per 3 min a 20 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di soluzione di calcio II contenente 100 mM CaCl 2. Disperdere i miociti con il trasferimento pipetta fine-tip pipettandosu e giù. </li><li> Ripetere il passaggio precedente (5.8) utilizzando rispettivamente soluzione di calcio III (400 mM CaCl 2) e IV (900 mM CaCl 2). </li><li> Per il mouse miociti coltura primaria, risospendere il pellet miociti finale in 5 ml di placcatura mezzo. Contare il numero totale di miociti e calcolare la percentuale di miociti astiformi. </li></ol> 6. Cell Culture <ol><li> Regolare la concentrazione dei miociti a forma di bastoncello a 25.000 a forma di bastoncello miociti / ml in una provetta da 50 ml. Pipettare delicatamente i miociti con una pipetta 10 ml di sospendere bene. Evitare di sedimentazione cella nella pipetta e provetta per garantire densità delle cellule uguali per ogni piatto o piatto. </li><li> Dopo aspirando al largo della soluzione di rivestimento laminina, piatto miociti in quei piatti o piatti. Scorrere delicatamente i piatti o piastre in avanti e da tre a quattro volte arretrate e da lato a lato in un modello a croce sulla superficie della cappa coltura. </li><li> Porre le capsule o le piastre in un 2% di CO2 incubatore a 37 ° C. Incubare per 1-3 ore per consentire attaccamento miociti ad una velocità di circa 80%. </li><li> Dopo l&#39;attacco, delicatamente aspirare fuori dal terreno contenente miociti slegati e detriti cellulari. Aggiungere delicatamente terreno di coltura ai lati dei piatti o piastre. Eseguire questo mezzo cambiamento uno per uno. Restituire immediatamente i piatti o piastre per l&#39;incubatore. </li><li> Dopo coltura O / N, i miociti possono essere modificati per lo stesso mezzo, senza BDM prima studi di segnalazione cellulare a breve termine. Tenere il BDM nella cultura lungo termine per le analisi ipertrofiche o apoptosi. Nota: BDM (2,3-butanedione monoxime) possono inibire la miosina-ATPasi e prevenire la contrazione. La sua inibizione della contrazione basata miosina-è facilmente reversibile. È stato riferito che BDM può avere alcuni effetti collaterali, come ad esempio in qualità di fosfatasi non specifico, aumentando il rilascio di calcio da SR, e l&#39;alterazione della concentrazione di calcio libero e cellulare prope elettricaproprietā, quindi prima del trattamento, il BDM deve essere rimosso. Inoltre, in alcuni casi, un inibitore specifico blebbistatin miosina II potrebbe essere un farmaco alternativo per inibire la contrazione dei cardiomiociti 8,9. Tuttavia, nel nostro caso, BDM è meglio che blebbistatin per motivi di qualità e quantità dei cardiomiociti. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per la migliore preparazione, i passaggi più critici sono: 1) prontamente agganciando il cuore del mouse alla cannula dopo l&#39;asportazione; 2) perfusione cardiaca appropriata. Si noti inoltre che la qualità dell&#39;acqua, la temperatura perfusione, pH del tampone, la sterilizzazione, la purezza chimica e pulito, tubi e camere non contaminati sono anche fattori importanti. 18.2 mW biologia molecolare-grade H 2 O è altamente raccomandato per la preparazione del buffer. Il pH della soluzione madre ATP 200 mM deve essere regolato a 7.2, un passo che è facilmente perdere. È essenziale identificare rapidamente l&#39;aorta e tagliare appena sotto il primo ramo come dimostrato da Flynn 13. Per efficiente hook-up, si raccomanda una cannula in acciaio inox di dimensioni adeguate, con tacche e fascetta piccola croce seghettato. Dopo la legatura, la punta della cannula deve essere al di sopra della valvola aortica per aiutare la collagenasi interagire pienamente con tessuto cardiaco durante la circolazione coronarica. A volte, la resa cellulare sembra grande inizialmentema molte cellule sono dopo la fase di tolleranza calcio di forma circolare. Una spiegazione è che il sangue coagulato nei vasi non può essere completamente rimosso dal cuore, che porta alla digestione insufficiente. Un&#39;altra possibilità è sopra digestione del cuore. L&#39;esposizione prolungata a collagenase riduce miociti calcio tolleranza 2. Durante la dissociazione e la reintroduzione di calcio ed è importante anche per gestire i cardiomiociti il ​​più delicatamente possibile per mantenere la vitalità dei miociti. In sintesi, la cultura cardiomiociti adulti da topi geneticamente modificati è un potente strumento per la ricerca cardiaca. Tuttavia, il lavoro futuro dovrebbe tenere a mente la differenza genetica tra umani e roditori quando si interpretano i risultati.

Cardiomiociti non sono proliferativa. Ci sono alcune linee cellulari cardiomiociti atriali, come HL-1 e cellule AT-1 derivate da tumori atriali topo; Tuttavia, non ci sono ventricolari adulto linee cellulari di cardiomiociti disponibili per la ricerca. Colture cellulari primarie di cardiomiociti adulti topo forniscono un modello potente per la ricerca di cuore a livello cellulare e molecolare. Ad oggi, sono stati ampiamente utilizzati per la biochimiche, fisiologiche e farmacologiche di ricerca 1. Inoltre, l&#39;uso frequente di topi geneticamente modificati ha richiesto metodi efficaci di isolamento dei cardiomiociti. Coltura pura permette condizioni di libero dall&#39;interazione con altri organi e circolazione sistemica, ad esempio attraverso fattori endogeni neurormonali e ormoni 2,3. Tuttavia, il successo isolamento di cardiomiociti può essere impegnativo. Il protocollo introduciamo contenute sono basate sulle nostre esperienze con adulti di ratto cardiomyocytes e il metodo descritto da O&#39;Connell et al 4,5. Soprattutto nel 2007 5, hanno descritto le tecniche dettagliate da preparazioni cuscinetto per coltura cellulare e saggio funzionale. Poiché miociti mouse sono molto sensibili alla contrattura rispetto ai cardiomiociti di ratto, i buffer o supporti utilizzati per la perfusione, digestione, Ca 2 + tolleranza, placcatura e cultura nel protocollo del mouse sono integrate con un inibitore di accoppiamento eccitazione-contrazione non specifico, 2, 3-butanedione monoxime (BDM) per inibire la loro contrazione spontanea, e quindi la redditività e la resa dei miociti a forma di bastoncello migliorare in modo significativo. Nel protocollo introdotto qui, i miociti sono separati in un buffer di potassio dal cuore isolato da modificata perfusione Langendorff con collagenasi di tipo II. Collagenase II rompe efficacemente la matrice intercellulare e cellule rilascia. La soluzione perfusione mantiene anche il metabolismo cellulare a un livello basso 6. In additi, il sistema cuore isolato dalla Harvard Apparatus che abbiamo usato qui è ben progettato per un preciso controllo della temperatura e pressione costante 7. Questo approccio fornisce preparazioni altamente riproducibili e popolazioni omogenee di tipo singola cellula, che può essere utilizzato in coltura durante la notte per misurare proteine ​​di segnalazione o coltura 2-3 settimane per saggi ipertrofiche cardiaci.

<table><tbody><tr><td>Isolated heart system for small rodent</td><td>Harvard Apparatus</td><td>IHSR-mouse 73-4019</td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-2816</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11294-00</td><td></td></tr><tr><td>Straight sharp serrated scissors</td><td>Fine science tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>Serrated Graefe forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved, serrated Graefe forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Straight Mini Serrefines clamps</td><td>Fine science tools</td><td>18054-28</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11575-032</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Mucosal universal detergent</td><td>Sigma</td><td>Z637181</td><td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

I progressi tecnologici hanno reso i topi geneticamente modificati, compresi transgenici e topi knockout gene, uno strumento essenziale in molti campi della ricerca. Cardiomiociti adulti sono ampiamente accettati come un buon modello per la fisiologia cellulare cardiaca e fisiopatologia, così come per intervento farmaceutico. Topi geneticamente modificati escludono la necessità di processi di infezione cardiomiociti complicati per generare il genotipo desiderato, che sono inefficienti a causa differenziazione terminale cardiomiociti. Isolamento e la coltura di grande quantità e qualità cardiomiociti funzionali drammaticamente a beneficio ricerca cardiovascolare e fornire un importante strumento di segnalazione cellulare di ricerca trasduzione e lo sviluppo di farmaci. Qui, descriviamo un metodo consolidato per l&#39;isolamento di cardiomiociti adulti mouse che possono essere implementati con poca formazione. Il cuore del mouse viene asportato e cannulata per un sistema cuore isolato, poi perfusi con un p privo di calcio e altaotassium tampone seguito dal tipo II collagenasi digestione in Langendorff modalità di perfusione retrograda. Questo protocollo produce un risultato coerente per la raccolta dei cardiomiociti funzionali topo adulto da una varietà di topi geneticamente modificati.

1. Quantificazione Isolamento di successo Due sono i criteri utilizzati per quantificare il successo dell&#39;isolamento: in primo luogo, il numero totale di cardiomiociti isolati, e secondo, il rapporto calcio-tolerant per arrotondare miociti non tolleranti a forma di asta. Generalmente questo protocollo richiede intorno 75-90 minuti dalla rimozione di cuore a placcatura miociti e le rese circa 1 milione di cardiomiociti a forma di bastoncello (70-90% dei miociti totali raccolti) da un cuore di topo adulto. Questo può variare con il peso corporeo del mouse e la tensione. Tipicamente, 0,7-1,0 milioni di miociti a forma di bastoncello possono essere raccolti da un ~ 25 g topo C57BL/6J, 1,2-1.600.000 miociti a forma di bastoncello da un ~ 35 g nero del mouse svizzero, e 0,7-1.200.000 miociti a forma di bastoncello può essere raccolto da un g Na / K-ATPasi eterozigoti ~ 30 (α1 S / R) 10 o ~ 22 g cardiaco specifico NCX-KO topo 11. Isolato miociti normalmente hanno una canna a forma distinta con estremità rettangolari e chiare trasversali striature,mostrato in Figura 1. 2. Identificazione funzione delle cellule I nostri dati precedenti hanno mostrato chiaramente che in coltura cardiomiociti neonatali di ratto, 100 micron ouabain può attivare PI 3 K-dipendente fosforilazione di Akt e indurre ipertrofia 12. Ad ulteriore conferma di questi risultati in cardiomiociti topo adulto, cardiomiociti di topo C57BL/6J adulto sono state coltivate e trattati con ouabain. Figure 2 e 3 mostrano chiaramente che ouabain può aumentare fosforilazione Akt in maniera dose-dipendente e indurre [3 H]-leucina incorporazione durante la sintesi proteica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51357/51357fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51357/51357fig1.jpg" /> Figura 1. Cardiomiociti a forma di bastoncello normale dal mouse Black svizzera dopo una nottecultura. miociti sono stati fotografati al microscopio a contrasto di fase utilizzando il software fotografico. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51357/51357fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51357/51357fig2.jpg" /> Figura 2. Attivazione di Akt da ouabain in colture di cardiomiociti adulti topo C57BL/6J. Miociti sono stati esposti a 0-50 micron ouabain per 5 minuti, e lisati sono stati analizzati per fosforilata (Ser 473) Akt (p-Akt) e Akt da ovest macchie. L&#39;attivazione è stata quantificata come rapporto di fosforilata da Akt totale (n = 5-10). * P &lt;0.05 vs controllo, ** p &lt;0.01 vs controllo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51357/51357fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51357/51357fig3.jpg" /> Figura 3. Ouabain stimola la sintesi proteica in coltura cardiomiociti di topo adulto C57BL/6J Dopo deprivazione di siero 4 hr, miociti sono stati trattati con le condizioni indicate in presenza o assenza di ouabaina o 100 nM ET-1 (controllo positivo) insieme con [3 H]. - leucina (1 uCi / ml) per 12 ore. I lisati cellulari sono stati precipitati con 5% TCA e risospese in 0,2 M NaOH/0.1% SDS, e la radioattività è stato contato in un contatore a scintillazione. La sintesi proteica per campione è stata calcolata cpm / mg di proteina e normalizzato rispetto al controllo. <table border="0"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Soluzione / Buffer </td><td> Perfusione Buffer </td><td> Digestion Buffer </td><td> Smettere di buffer </td><td> Ca 2 + Soluzione </td><td> Ca 2 + Solution II </td><td> Ca 2 + Solution III </td><td> Ca 2 + Solution IV </td></tr><tr><td&gt; NaCl, mM </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td> KCl, mM </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4, mM </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4, mM </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> MgSO4, mM </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> Na-HEPES, mM </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> NaHCO 3, mM </td><td> 12 </td><td> 12 </td><td>12 </td><td> 12 </td><td> 12 </td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KHCO 3, mM </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Rosso fenolo, mM </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> Taurina, mM </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> BDM, mM </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Glucosio, mM </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> FBS,% (v / v) </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Collagenase II, mg / ml </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> CaCl 2, pM </td><td> 0 </td><td> 50 </td><td> 0 </td><td> 12.5 </td><td> 100 </td><td> 400 </td><td> 900 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Soluzioni / buffer per cardiomiociti di topo adulto isolamento. <table border="0"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Catalog # </td><td> Preparazione </td><td> Conservazione </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> Atlanta Biolgoicals </td><td> S11550 </td><td> N / A </td><td> Aliquote di 25 ml di sterile 50 ml provette a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Albumina sierica bovina (BSA) 100 mg / ml, 100x </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td> 5 g in 50 ml DIH 2 O, filtra attraverso sterile 0,22 micron siringa sterile filter </td><td> 5 ml aliquote in sterili provette da 15 ml a -20 ° C. </td></tr><tr><td> CaCl 2 100 mm, 100x </td><td> Sigma </td><td> C4901 </td><td> 0,555 g in 50 ml DIH 2 O, e il filtro sterile con 0,22 micron filtro a siringa sterile </td><td> 10 ml aliquote in sterili provette da 15 ml a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> Laminina 1 mg / ml, 100x </td><td> Tecnologie della vita </td><td> 23017-015 </td><td> N / A </td><td> 200 microlitri aliquote in sterili da 0,5 ml microprovette a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 2,3-butanedione monoxime (BDM) 500 mm, 50x </td><td> Sigma </td><td> B0753 </td><td> 1.01 g BDM in 20 ml diH 2 O, sterilizzare la soluzione filtrando attraverso 0,22 micron filtro cappa. </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Adenosina-5&#39;-trifosfato sale disodico (Na 2-ATP) 200 mm, 100x </td><td> Sigma </td><td> A6419 </td><td> Aggiungere 5 ml diH 2 Oa sciogliere 1 g di Na 2-ATP in provetta da centrifuga 50 ml, quindi utilizzare 2 mol / l NaOH per regolare il pH a 7,2 e portare il volume finale a 9 ml con diH 2 O. sterilizzare la soluzione attraverso 0,22 micron filtro a siringa. </td><td> Aliquote da 0,5 ml a 1,5 ml microprovette sterili a -20 ° C. </td></tr><tr><td> NaCl 3.77 M, 33.3x </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> 66 g in 300 ml diH 2 O </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> KCl 470 mM, 100x </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217 </td><td> 3,5 g in 100 ml diH 2 O </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 60 mm, 100x </td><td> Sigma </td><td> P5379 </td><td> 0,82 g in 100 ml diH 2 O </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 60 mm, 100x </td><td> Sigma </td><td> S0876 </td><td> 0,85 g in 100 ml diH 2 O </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> MgSO 4 120 mm, 100x </td><td> Sigma </td><td> M-1880 </td><td> 3 g in 100 ml diH 2 O </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> HEPES 1 M, 100x </td><td> Tecnologie della vita </td><td> 15630-080 </td><td> N / A </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> NaHCO 3 600 mm, 50x </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> 10.1 g in 200 ml diH 2 O </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> KHCO 3 1 M, 100x </td><td> Fisher Scientific </td><td> P235 </td><td> 10.1 g in 100 ml diH 2 O </td><td> conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Rosso fenolo 3,2 mm, 100x </td><td> Sigma </td><td> P5530 </td><td> 0,12 g in 100 ml diH 2 O </td><td> conservare a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Della preparazione della soluzione e di stoccaggio per topo adulto cardiomiociti isolamento e la coltura. </strong&gt;

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Descriviamo un metodo affidabile per l&#39;isolamento di cardiomiociti di topo adulto. Questo protocollo produce un risultato coerente per la cultura di cardiomiociti adulti funzionali da una varietà di topi geneticamente modificati.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.5K Views.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  Descriviamo un metodo affidabile per l'isolamento di cardiomiociti di topo adulto. Questo protocollo produce un risultato coerente per la cultura di cardiomiociti adulti funzionali da una varietà di topi geneticamente modificati. 

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Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Ricerca

Biologia

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

Isolamento e coltura dei cardiomiociti di ratto adulto.

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Medicina

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e

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L'isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging