È stato adottato un approccio semplice per monitorare i cambiamenti nella proteostasi valutando l'aggregazione di poliglutammine e fornendo un framework che può essere utilizzato per applicazioni ad alto rendimento. Segnare un fenotipo come il numero di aggregati per I può diventare soggettivo. L'automazione del conteggio degli aggregati ci consente di eliminare tali distorsioni, aumentare il throughput e la riproducibilità.
Questo metodo aiuta a identificare i geni batterici che contribuiscono all'interruzione della proteostasi dell'ospite. Comprendere il contributo dei singoli geni batterici ci aiuterà a capire la sua implicazione nella patogenesi di malattie come l'Alzheimer, il Parkinson e l'Huntington. Inizia rimuovendo le piastre contenenti vermi dal congelatore e lasciandole scongelare a temperatura ambiente.
Quindi rimuovere la condensa in eccesso e rimuovere il coperchio prima dell'imaging. Utilizzare le impostazioni del microscopio con tempo di esposizione di 500 millisecondi, ingrandimento di 40 X con adattatore per fotocamera 0,63 X e intensità GFP impostata su 100% durante l'acquisizione dell'immagine. Ora regola i controlli della luce trasmessa fino a quando i vermi appaiono illuminati rispetto allo sfondo scuro, evitando la sovraesposizione.
Modificare le posizioni dei vermi all'interno del pozzo per evitare eccessivi grumi utilizzando una punta della pipetta da 10 microlitri per spingere delicatamente i vermi nella posizione desiderata. Impostate il canale sul filtro GFP per stabilire un piano focale per entrambe le immagini. Cattura un'immagine in campo luminoso.
Scatta un'immagine di fluorescenza corrispondente senza disturbare la piastra o cambiare la messa a fuoco del microscopio. Ora per valutare le immagini, prima scarica CellProfiler. Apri il software e trascina e rilascia le immagini di interesse nella casella delle immagini.
Fare clic sulle immagini nell'elenco dei file per aprirle. Selezionare la lente di ingrandimento per evidenziare un'area di interesse e l'icona della freccia per misurare la lunghezza sia dei worm che degli aggregati. Passa il mouse sopra l'oggetto desiderato per determinarne il valore di intensità, che può essere visualizzato nella parte inferiore dello schermo.
Per utilizzare la pipeline di analisi delle immagini di CellProfiler, denominare correttamente le coppie di immagini come descritto nel manoscritto di testo dopo aver scaricato CellProfiler dal sito Web ufficiale. Scaricare la pipeline e caricarla in CellProfiler selezionando file, importa e pipeline da file. Selezionare il modulo worm districati per aprirne le impostazioni e caricare un set di addestramento utilizzato per identificare i worm nel modulo worm districati.
Quindi identificare il nome del file del set di allenamento. Seleziona l'icona di caricamento del file e carica anche il file supplementare. Carica le immagini selezionando il modulo immagini nell'angolo in alto a sinistra.
E poi trascina e rilascia immagini con nome corretto. Prima di analizzare le immagini, selezionare la cartella di output desiderata che verrà utilizzata per memorizzare i risultati facendo clic sul pulsante delle impostazioni di output situato vicino all'angolo in basso a sinistra del programma. Quindi selezionare l'icona della cartella a destra dell'output predefinito per scegliere la posizione di output desiderata.
Selezionare l'icona Analizza immagini per iniziare l'analisi delle immagini. Se il completamento dell'analisi richiede troppo tempo ed è bloccata durante l'elaborazione di una singola immagine, interrompere l'esecuzione e identificare l'immagine non elaborata ordinando la cartella di output e notando quale nome immagine non viene trovato. Dopo un'analisi completa, il software organizzerà i risultati in un foglio di calcolo Excel contenente singoli worm nella colonna N e il rispettivo numero di aggregati nella colonna K.Scarica l'organizzatore di metadati per organizzare comodamente i dati dal file CSV di output di CellProfiler.
Per il sistema operativo Windows, individuare il file scaricato ed estrarlo nella posizione desiderata. Individuare e aprire la cartella estratta denominata gui_Windowsos_64x. E avvia l'applicazione facendo clic sull'icona dell'applicazione GUI.
Potrebbe aprirsi un prompt che richiede l'autorizzazione per l'esecuzione. Seleziona ulteriori informazioni e quindi fai clic su Esegui comunque. L'organizzatore di metadati è ora pronto per trascinare e rilasciare i file CSV di output di CellProfiler.
Per Mac OS, individuate il file scaricato ed estraete il file dell'applicazione dell'organizzatore dei metadati del file. Apri la cartella estratta trovata nei download. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'applicazione GUI e selezionare Apri.
Apparirà un prompt che chiede il permesso di aprire a causa della mancanza di una licenza ufficiale. Seleziona Apri. Una volta che l'applicazione di metadata organizer è aperta nel rispettivo sistema operativo, fare clic su carica i file qui o trascinare e rilasciare i file CSV CellProfiler desiderati.
Fare clic sul pulsante Organizza, che porterà l'utente a una nuova schermata con un pulsante di download dei file. Fare clic sul pulsante e selezionare la posizione desiderata per salvare il file di output. Il file di output verrà visualizzato come nome del file originale con _organized estensione aggiunta al nome del file.
In presenza di FUDR, i vermi che sono stati alimentati con vari batteri avevano una dimensione corporea più consistente che consentiva un rilevamento dei vermi più uniforme e accurato, risolvendo così il problema del sovraffollamento. Il congelamento dei worm ha migliorato il rilevamento degli aggregati polyQ eliminando la fluorescenza di fondo e l'accuratezza del conteggio automatizzato paragonabile al conteggio manuale. L'illuminazione a campo luminoso invertito è stata utilizzata per rilevare l'intero canale C.elegans e GFP per l'immagine di aggregati polyQ YFP.
Il rilevamento, il distringolo e la quantificazione aggregata dei worm per ogni worm sono stati eseguiti applicando una pipeline di elaborazione delle immagini CellProfiler ottimizzata, che consente di ottenere il numero di aggregati per singolo worm. La differenza tra l'efficacia della quantificazione automatizzata degli aggregati e l'utilizzo della pipeline CellProfiler era minima, indicando che il metodo automatizzato può essere applicato a schermi su larga scala. Su 90 ceppi batterici testati, la colonizzazione dell'intestino di C.elegans con un candidato ha mostrato una significativa diminuzione del numero di aggregati.
Gli esperimenti di conferma mediante conteggio manuale hanno rivelato che nessuno dei mutanti, incluso quello che ha ridotto significativamente il numero di aggregati, ha influenzato l'aggregazione polyQ. I ricercatori che decidono di utilizzare questo framework dovrebbero capire che i passaggi delineati non sono assoluti. La modifica e una comprensione fondamentale di come manipolare CellProfiler sono essenziali per il successo.
Ulteriori approcci biochimici come il western blotting possono essere utilizzati per confermare l'aggregazione polyQ.
