Questo protocollo delinea i passaggi per indurre un'infiammazione oculare affidabile e robusta utilizzando micobatteri uccisi dal calore nel modello murino. Questo modello di uveite micobatterica innescata può aiutare a studiare i meccanismi dell'infiammazione oculare cronica immunomediata che si sviluppa dopo un'infezione micobatterica. Questo modello di uveite cronica non richiede l'uso di ceppi murini specifici o l'immunizzazione con antigeni oculari.
Questo modello facilita l'uso di linee murine transgeniche e geniche knockout negli studi meccanicistici della patogenesi dell'infiammazione oculare. Questo modello di PMU sarà utile negli studi che testano nuove terapie per l'infiammazione oculare o l'uveite negli esseri umani. Trattamenti come nuovi colliri o agenti immunomodulanti somministrati per via sistemica potrebbero essere testati per l'efficacia con questo modello.
Questo modello faciliterà lo studio di come gli antigeni micobatterici uccisi dal calore alterano il microambiente di un organo immunitario privilegiato come l'occhio. Questi risultati potrebbero anche fornire approfondimenti su come altri tipi di infezione oculare influenzano l'occhio o su come i siti privilegiati immunitari, come il cervello, rispondono agli antigeni microbatterici. Per iniziare, sblocca il corpo dell'unità convertitore Sonicator e pulisci la sonda con un tampone alcolico al 70%.
Quindi accendere il Sonicator e regolare l'impostazione di potenza su quattro ruotando la manopola di controllo dell'alimentazione. Successivamente, per generare una sospensione fine del microbatterio tuberculosis H37Ra in PBS, immergere la punta della sonda nella polvere microbatterica contenente PBS. Sonicare la miscela sul ghiaccio per 30 secondi, quindi mettere in pausa per 30 secondi e ripetere per un totale di cinque minuti per disperdere completamente la polvere in una sospensione uniforme senza riscaldare il liquido.
Quindi, aggiungere 2,5 millilitri di Incomplete Adjuvant di Freund alla miscela e ripetere il processo di sonicazione sul ghiaccio fino a quando l'emulsione forma una consistenza simile al dentifricio. Per l'iniezione sottocutanea, caricare da 200 a 300 microlitri di emulsione microbatterica in una siringa da un millilitro. Espellere l'aria dalla siringa e continuare a riempirla con l'inversione intermittente e il picchiettamento fino al riempimento.
Quindi, posizionare le iniezioni sottocutanee sulla superficie dorsale dei fianchi o sulla superficie ventrale delle gambe prossimali alla regione dei linfonodi inguinali di un topo C57 nero 6J anestetizzato di 6-10 settimane. Inserire con cautela l'ago, facendo attenzione a non penetrare nel muscolo, e iniettare 50 microlitri di emulsione nello spazio sottocutaneo. Non rimuova immediatamente l'ago per consentire la completa iniezione dell'emulsione densa.
Per preparare lo stock di antigene per l'iniezione intravitreale, sonicare l'H37Ra in soluzione PBS come dimostrato in precedenza, quindi aliquotare la soluzione in volumi da 100 microlitri e conservare a 20 gradi Celsius. Il giorno dell'iniezione, dopo aver confermato la profondità dell'anestesia generale, anestetizzare la cornea con una goccia di tetracaina allo 0,5% e dilatare la pupilla con una goccia di fenilefrina al 2,5%. Dopo aver tamponato il liquido in eccesso, aggiungere una goccia di 5% Betadine sulla superficie dell'occhio e sui capelli circostanti per ridurre il rischio di endoftalmite.
Dopo due o tre minuti, rimuovere il Betadine e coprire l'occhio con gel di ipromellosa allo 0,3% per prevenire la secchezza sotto anestesia e la formazione di cataratta. Quindi, caricare una siringa da 10 microlitri con la miscela di antigene e fluoresceina, quindi posizionare il mouse in posizione prona sulla piattaforma e utilizzare le barre auricolari destra e sinistra per fissare la testa del mouse. Posizionare e orientare il mouse sotto il cannocchiale in modo che sia visibile l'aspetto nasale superiore dell'occhio destro.
Quindi, utilizzando un ago calibro 30, spostare le ciglia, esporre la sclera e visualizzare il limbus e il vaso sanguigno radiale. Quindi, usando un ago sterile da 30 gauge, praticare un foro guida nella sclera da uno a due millimetri posteriormente al limbus. Quindi, inserire l'ago di calibro 34 attaccato al supporto per iniezione nell'occhio, attraverso il foro guida, con un angolo che eviti la lente, ma posizionare la punta dell'ago nella cavità vitreale.
Utilizzando un controller per micro pompa a siringa, iniettare con cura un microlitro di estratto di M.tuberculosis nella cavità vitreale. In caso di reflusso costante, aumentare il volume di iniezione a 1,5 microlitri per garantire un'adeguata erogazione della dose. Confermare il posizionamento intravitreale visualizzando un riflesso verdastro nell'occhio e, dopo 10 secondi, rimuovere l'ago dall'occhio.
Dopo aver anestetizzato il topo, dilatare la pupilla con una goccia di fenilefrina al 2,5%, evitando che le goccioline in eccesso entrino nel naso o nella bocca. Dopo due o tre minuti, tamponare il liquido in eccesso e coprire l'occhio con gel di ipromellosa allo 0,3%. Quindi, avvolgere il mouse in uno strato di garza chirurgica per mantenere il calore del corpo, quindi posizionare il mouse sulla cassetta dell'animale e posizionare la testa con la barra del morso.
Per acquisire la tomografia a coerenza ottica o le immagini OCT, accendere il sistema di imaging OCT e aprire il software di imaging. Per l'imaging della camera posteriore, avvicinare l'OCT alla superficie dell'occhio, facendo attenzione a non portare la superficie della lente a contatto con l'occhio. Una volta posizionato correttamente l'occhio, interrompere la scansione veloce, selezionare il protocollo di scansione del volume e attivare la scansione con l'opzione Mira.
Per le immagini del segmento posteriore, regolare fino a quando il nervo ottico è centrato nell'immagine di allineamento della scansione B orizzontale e la retina è allineata con l'asse di allineamento verticale. Per le immagini del segmento anteriore, regolare la posizione per centrare l'apice della cornea sia nell'immagine di allineamento orizzontale B-scan che nell'immagine di allineamento verticale B-scan. Infine, fai clic su Istantanea per acquisire l'immagine di scansione del volume, quindi fai clic su Salva.
24 ore dopo l'iniezione intravitreale, le cellule infiammatorie sono osservate nell'acquoso e nel vitreo. Edema corneale, un ipopione e cellule infiammatorie multiple fluttuanti sono osservate nella camera anteriore e vitrite nella camera posteriore. Il grado di infiammazione oculare può essere valutato su queste immagini OCT.
I punteggi combinati superiori a zero ma inferiori a 2,5 rappresentano un'infiammazione lieve. Punteggi superiori a 2,5, ma inferiori a 4,5. rappresentano un'infiammazione moderata e punteggi superiori a 4,5 identificano un'infiammazione grave.
I punteggi di infiammazione possono anche essere determinati utilizzando cinque caratteristiche visibili nelle sezioni di colorazione dell'ematossilina e dell'eosina. Il punteggio di gravità è determinato contando il numero di cellule infiammatorie nell'acquoso e nel vitreo. L'imaging longitudinale del fondo oculare a campo luminoso può anche identificare l'infiammazione retinica e perivascolare.
Gli occhi gravemente infiammati mostrano molteplici infiltrati bianchi nella retina e tortuosità vascolare all'imaging del fondo oculare colorato, nonché vitrite densa ed edema retinico nell'OCT il secondo giorno. Gli occhi lievemente infiammati mostrano meno e più discrete lesioni lineari nel fondo oculare e un numero di cellule infiltranti nello spazio vitreo. Garantire la coerenza durante le iniezioni sottocutanee e intravitreali e adottare misure appropriate per prevenire lo sviluppo di endoftalmite infettiva sono i passaggi chiave che aiutano a replicare con successo questo modello.
L'imaging a bioluminescenza in vivo può essere utilizzato per caratterizzare l'infiammazione, mentre i saggi post-mortem, come l'analisi citometrica a flusso multiparametrica, possono essere eseguiti per identificare e quantificare le popolazioni di cellule immunitarie infiltranti. L'analisi delle citochine, il sequenziamento dell'mRNA e l'imaging a immunofluorescenza possono essere utilizzati per valutare i modelli di espressione genica e proteica o identificare le popolazioni di cellule immunitarie retiniche nell'uveite. Questo protocollo mostra come eseguire iniezioni riproducibili, asettiche e minimamente traumatiche che aiuteranno i futuri ricercatori ad accedere allo spazio intravitreale nei topi.
L'OCT svolgerà anche un ruolo importante nel rilevare l'infiammazione oculare che altrimenti potrebbe essere persa da un esame visivo degli occhi di piccoli animali da esperimento.
