Il potenziamento della fluorescenza indotto da singole molecole e proteine può integrare le misurazioni FRET a singola molecola quando si studiano sottopopolazioni e conformazioni strutturali proteiche, specialmente nei casi in cui sottopopolazioni strutturali distinte riportano strutture locali stabili. Il vantaggio principale di questa tecnica è che cattura sotto-popolazioni strutturali distinte specifiche del sito in base alla vicinanza del sito di etichettatura del colorante alle superfici proteiche. Il miglioramento della fluorescenza indotto da proteine a singola molecola può essere applicato a qualsiasi sistema biomolecolare di interesse per sondare sottopopolazioni strutturali distinte, locali.
Iniziare preparando 25 alfa-sinucleina picomolare con sulfo-Cy3 in un tampone di misurazione in un tubo a basso legame proteico. Aggiungere 100 microlitri di un milligrammo per millilitro BSA al vetrino di copertura per microscopia a 18 camere e incubare per un minuto, quindi scartare il BSA. Aggiungere 100 microlitri di 25 campioni di alfa-sinucleina picomolare con etichetta Sulfo-Cy3 nella camera del vetrino di scorrimento del coperchio.
Successivamente, per l'acquisizione dei dati, aggiungere una goccia di acqua ultrapura sulla parte superiore dell'obiettivo ad immersione in acqua ad alta apertura numerica, fissare il vetrino di scorrimento del coperchio nella camera dello stadio e quindi installare l'assemblaggio sulla parte superiore dello stadio del microscopio. Portare la lente dell'obiettivo verso l'alto fino a quando la goccia d'acqua sulla parte superiore della lente dell'obiettivo si spalma nella parte inferiore della slitta di scorrimento del coperchio e aprire l'otturatore laser. Quando l'obiettivo si sposta verso l'alto, ispezionare il modello degli anelli ariosi su una telecamera CCD.
Il primo anello rappresenta il focus sull'interfaccia acqua/vetro e il secondo anello rappresenta il focus sull'interfaccia tra il vetro e la soluzione campione. Aumentare l'altezza della lente dell'obiettivo di 75 micrometri per portare la messa a fuoco laser in profondità nella soluzione per ridurre al minimo l'autofluorescenza dalla superficie di vetro dello slittamento del coperchio. Sintonizzare la potenza del laser sulla lente dell'obiettivo di circa 100, microwatt.
Avviare l'acquisizione dei fotoni rilevati per un tempo predefinito. Aprire i blocchi appunti jupyter, quindi aprire il blocco appunti di esempio. Caricare il file di dati FRETBursts e Photon-HDF5.
Utilizzare l'istogramma dei tempi interfotoni per calcolare le frequenze di sfondo per ogni 30 secondi di acquisizione dei dati. Spostare una finestra temporale di un fotone alla volta per 20 fotoni consecutivi e raccogliere i dati del fotone se la velocità istantanea del fotone F è almeno 11 volte maggiore della velocità di sfondo per quel periodo di acquisizione dei dati. Calcola la dimensione del burst e la quantità di fotoni in un burst, la durata del burst, la differenza di tempo tra i tempi di rilevamento dell'ultimo e del primo fotone in un burst, la luminosità del burst, il valore più grande del tasso di fotoni istantanei in un burst e la separazione burst, l'intervallo di tempo tra burst consecutivi.
Traccia l'istogramma dei valori di luminosità di burst con l'asse degli eventi in una scala logaritmica. Definite la soglia di luminosità di burst come il valore minimo di luminosità di burst da cui l'istogramma presenta un pattern di decadimento e seleziona i burst con valori di luminosità superiori alla soglia di luminosità burst. Per la misurazione della durata media della fluorescenza di burst, tracciare l'istogramma del nanotempo dei fotoni per tutti i fotoni nelle esplosioni selezionate con l'asse di conteggio dei fotoni in una scala logaritmica.
Definire la soglia nanotime come il valore nanotime minimo da cui l'istogramma dei nanotime fotoni mostra un pattern di decadimento. Selezionare solo i fotoni con nanotime più grandi della soglia nanotime. Calcola la media algebrica di tutti i nanotempi di fotoni selezionati.
Sottrarre la soglia nanotime dalla media algebrica nanotime del fotone. Il valore ottenuto è il nanotempo medio dei fotone del burst, direttamente proporzionale alla durata media della fluorescenza. Traccia l'istogramma di tutte le vite di fluorescenza media di burst.
Possono comparire le sottopopolazioni distribuite centralmente della durata di fluorescenza. Le sottopopolazioni con medie di valore inferiore rappresentano le specie molecolari con Sulfo-Cy3 che non sono state ostruite stericamente, mentre le sottopopolazioni con medie di valore più alto rappresentano le specie molecolari con S-Cy3 che sono state ostruite più stericamente. Per la valutazione lenta della dinamica tra burst, tracciare l'istogramma dei tempi di separazione burst con un asse temporale di separazione in una scala logaritmica.
Selezionare questa opzione per salvare tutte le coppie di esplosioni consecutive separate da meno di un tempo di separazione massimo che definisce la sottopopolazione della stessa molecola. Traccia un istogramma o un grafico a dispersione della durata media della fluorescenza della prima e della seconda raffica per tutte le coppie di esplosioni che si sono ripresentate al di sotto di una certa soglia temporale di separazione. Gli istogrammi della durata media di fluorescenza di una singola molecola alfa-sinucleina-56 con etichetta S-Cy3 hanno mostrato che la prima sottopopolazione aveva una durata di fluorescenza caratteristica di 1,6 nanosecondi e rappresentava stati conformazionali di alfa-sinucleina con poche superfici proteiche in prossimità del residuo 56.
La seconda sottopopolazione aveva una durata di fluorescenza caratteristica di 3,5 nanosecondi e rappresentava stati conformazionali di alfa-sinucleina con più superfici proteiche in prossimità del residuo 56. I segmenti di componenti beta non amiloidi delle molecole di alfa-sinucleina sono noti per adottare una struttura elicoidale a forcina dopo il legame alle vescicole SDS, che è stata confermata come una singola popolazione di florescenza con una durata caratteristica di circa tre nanosecondi e l'assenza della sottopopolazione con la durata caratteristica di 1,6 nanosecondi. L'istogramma dei tempi di separazione tra scoppi consecutivi a singola molecola riporta molecole ricorrenti per i tempi di separazione più veloci di 100 millisecondi, dove il primo e il secondo scoppio derivano dalla stessa molecola.
L'istogramma medio della durata di fluorescenza di tutti i singoli burst di molecole ha mostrato sottopopolazioni con una breve durata caratteristica, nonché con una lunga durata caratteristica, il che indica che le singole molecole potrebbero subire transizioni tra diversi valori medi di vita più lenti dei tempi di durata dello scoppio. Entro tempi di separazione burst di 100 millisecondi al massimo, c'era una frazione di molecole che iniziava come un primo scoppio nella sottopopolazione di breve durata e si ripresentava come un secondo scoppio all'interno della sottopopolazione di lunga durata. Mentre la frazione di molecole che è iniziata come prima esplosione nella sottopopolazione di lunga durata, e si è ripresentata come seconda esplosione all'interno della popolazione di breve durata, indica le transizioni tra le due sottopopolazioni entro 10-100 millisecondi.
La cosa più importante da ricordare quando si analizzano i risultati sperimentali è separare correttamente i segnali di fluorescenza a singola molecola dallo sfondo e analizzare le esplosioni con abbastanza nanotempi di fotone. Lo sviluppo di smPIFE ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare le interazioni delle proteine degli acidi nucleici a livello di singola molecola. Questo progresso pone le basi per lo studio delle dinamiche strutturali locali all'interno delle proteine.
