Il protocollo qui descritto è appropriato per valutare le prestazioni delle zanzare transgeniche e i confronti con le controparti selvatiche in una piccola gabbia di laboratorio. Le prove a gabbia piccola sono importanti per fornire valori empirici che aiuteranno a riempire l'implementazione di nuove tecnologie per l'eliminazione della malaria. Le prove in gabbia possono essere adattate ad altri progetti sperimentali e sono adatte a valutare la dinamica di una minaccia di un trans-gene del desiderio.
A seguire l'introduzione di individui transgenici. Inizia la fase iniziale dell'esperimento allestendo tre gabbie da 0,216 metri cubi in triplicati. E aggiungendo 60 larve di tipo selvatico second-instar a ciascuna gabbia per tre settimane consecutive.
Ogni settimana, fornire femmine adulte in ogni gabbia con topi anestetizzati come fonte di farina di sangue. E un contenitore di deposizione delle uova tre giorni dopo il pasto di sangue. Schiudere le uova da ogni gabbia settimanalmente.
Dalla quarta all'ottava settimana, selezionare a caso 60 larve L2 seconde instar per tornare alle rispettive gabbie. Alla nona settimana, assegna in modo casuale un set di gabbie triplicate come controlli e un set per ogni rapporto di rilascio desiderato. Aggiungi 60 pupe selvatiche con 30 maschi e 30 femmine alle gabbie di controllo settimanalmente.
Mantenere un rapporto uno a uno in ogni rispettiva gabbia aggiungendo settimanalmente 30 pupe maschili transgeniche insieme a 60 pupe selvatiche. Per un rapporto da uno a 0,1, aggiungere 300 pupe maschili transgeniche alla settimana in ogni rispettiva gabbia insieme a 60 pupe selvatiche. Ripeti aggiungendo pupe di zanzara nella gabbia, fornendo farina di sangue e uova da cova ogni settimana.
Seleziona un totale di 300 larve da ogni gabbia a caso per lo screening. Schermare le larve al microscopio stereo con filtri a fluorescenza per l'espressione del marcatore fluorescente dominante a stadi larvali e pupali. Segna il sesso delle pupe risultanti.
Nell'esperimento di gene drive, impiegare una strategia di barriera mantenendo le zanzare in un insetto sicuro e seguendo procedure operative standard con monitoraggio regolare. Preparare una gabbia allestita con due set di gabbie triplicate da 0,216 metri cubi per ogni rapporto di rilascio tra maschio transgenico e selvaggio desiderato. Per ottenere un rapporto di rilascio maschile di uno a uno, aggiungere 120 maschi transgenici, 120 maschi e femmine selvatici allo stadio di pupa a ciascuna gabbia replicata.
Fornire un pasto di sangue usando topi anestetizzati a femmine di quattro o sette giorni in ogni gabbia. Dopo aver covato le uova in un vassoio larvale, selezionare circa 240 prime larve di instar L1 a caso da ogni gabbia e allevarle in pupe prima di tornare alle rispettive gabbie. Selezionare e selezionare le larve per il marcatore oculare e il fenotipo sessuale come descritto in precedenza.
Assemblare una configurazione a gabbia di gabbie triplicate da 0,005 metri cubi con un numero uguale di maschi e femmine per ogni specifico rapporto di rilascio di transgenici a maschi selvatici. Utilizzando un apparato di alimentazione artificiale, fornire pasti di sangue alle femmine di quattro-sette giorni in ogni gabbia per due giorni consecutivi. Tre giorni dopo il secondo pasto di sangue, aggiungere un contenitore di deposizione ovidezione e rimuovere i contenitori dopo tre giorni.
Dopo aver valutato tutti i morti e gli adulti vivi rimasti nella gabbia per sesso, conservali a meno 80 gradi Celsius per l'analisi molecolare. Schiudere le uova ed eseguire selezionare 200 larve L1 e mettere da parte le larve per popolare nuove gabbie per la prossima generazione. Quindi seleziona casualmente altre 500 larve da ogni gabbia messa da parte per lo screening.
Allevare le 200 larve selezionate a pupa e 500 larve allo stadio L4 instar. Ritorna pupa da 200 vassoi per popolare la nuova gabbia. Schermare le larve selezionate casualmente per il marcatore oculare e il fenotipo sessuale Come prima.
Nell'analisi rappresentativa, le dinamiche fenotipiche attese delle repliche più performanti sono mostrate per i diversi protocolli di sperimentazione delle gabbie di sostituzione della popolazione. I risultati hanno mostrato la percentuale lineare crescente di larve con fenotipo marcatore DsRed nell'arco di sette generazioni. Il rilascio uno a uno non-drive ha raggiunto poco più dell'80% di introduzione transgenica entro sette generazioni.
I protocolli di gene drive hanno raggiunto questo obiettivo entro tre o quattro generazioni. Convalidando così che un singolo rilascio di un sistema di gene drive può essere più efficiente per l'introduzione di transgenici. Alla fine dell'osservazione, la diffusione del transgene aveva raggiunto un'introduzione quasi completa nei sistemi di gene drive.
Parametri importanti, come il rapporto di rilascio della struttura per età della popolazione, le dimensioni della gabbia e altri, varieranno a seconda dello scopo dell'esperimento e degli obiettivi specifici. Si possono fare esperimenti per valutare parametri di fitness come fertilità e fecondità. Ulteriori dati più empirici delle prove in gabbia possono essere utilizzati per parametrizzare modelli matematici di dinamica della popolazione.
