Gli autori ringraziano i sig. e la Facoltà Core Facility per l'assistenza nell'imaging animale. Il lavoro è stato sostenuto dal Research Grant Council di Hong Kong (17300319).

Gli esperimenti condotti in questo studio sono stati approvati dal Committee on the Use of Live Animals for Teaching and Research (CULATR), The University of Hong Kong. Formulazioni in polvere secca preparate mediante liofilizzazione spray (SFD) contenenti lo 0,5% dell'RNA messaggero luciferasi (mRNA), il 5% di peptide sintetico PEG12KL4 e il 94,5% del mannitolo (w/w) sono utilizzate in questo studio per dimostrare l'espressione di mRNAnel polmone 16. Il diametro aerodinamico mediano di massa (MMAD) della polvere SFD è di 2,4 μm. La polvere di mannito essiccata a spruzzo (SD) viene utilizzata per studiare l'effetto del volume d'aria utilizzato nella dispersione dellapolvere 16. L'MMAD della polvere SD è di 1,5 μm.
1. Fabbricazione di insufflator a polvere secca e caricamento di polvere secca
<ol><li>(Facoltativo) Neutralizzare le cariche statiche della polvere secca (in una fiala) e la punta della pipetta di caricamento del gel rotonda non filtrante da 200 μL. Utilizzare una pistola antistatica o un equilibrio con funzione di deionizzazione secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Preparare una carta di pesatura con un formato di circa 4 cm x 4 cm. Piegare la carta a metà in diagonale e quindi aprirla.</li>
	<li>Pesare 1-2 mg di polvere secca sulla carta di pesatura.</li>
	<li>Riempire una punta di pipetta a caricamento in gel con polvere attraverso l'apertura più ampia della punta. Toccare delicatamente per imballare la polvere fino a quando la polvere non forma agglomerati sciolti vicino all'estremità stretta della punta(Figura 1A). Evitare di imballare la polvere troppo strettamente in quanto potrebbe ostacolare la dispersione della polvere.</li>
	<li>Collegare la punta caricata a polvere a una siringa da 1 ml attraverso un fermacock a tre velocità (Figura 1B). La dimensione della siringa può essere cambiata in base al volume d'aria utilizzato per disperdere la polvere. Tenere la punta e la siringa verticalmente durante il collegamento per evitare fuoriuscite di polvere. Se la somministrazione non viene eseguita immediatamente, utilizzare il parafilm per sigillare le aperture della punta e conservarla temporaneamente in condizioni adeguate fino alla somministrazione.</li>
</ol>2. Fabbricazione di dispositivi di intubazione
<ol><li>Sorgente luminosa(Figura 2)<ol>
<li>Preparare una sorgente luminosa su misura con una torcia a diodo emettitore di luce (LED) e una fibra ottica flessibile con un diametro di 0,8-1 mm.</li>
		<li>Crea un orifizio centrato sulla lente chiara della torcia a LED con un trapano a mano o una punta di perforazione in modo che la fibra ottica possa passare a malapena.</li>
		<li>Inserire la fibra ottica attraverso l'orifizio. Accendere la torcia a LED per regolare la posizione e la profondità di inserimento per la massima luminosità all'altra estremità della fibra ottica.</li>
		<li>Apporre la fibra ottica in posizione con colla epossidica chiara.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cannula guida(Figura 3)<ol>
<li>Prendere una pipetta Pasteur in plastica da 1 mL (Figura 3A) e tenere la pipetta ad entrambe le estremità.</li>
		<li>Utilizzare una lampada alcool (o altre fonti di calore in laboratorio come un bruciatore Bunsen) per riscaldare il centro della pipetta posizionandolo a 5-10 cm sopra la fiamma(Figura 3B). Ruotare la pipetta per assicurarsi che sia riscaldata uniformemente.</li>
		<li>Quando la plastica diventa morbida e deformabile, allontanare la pipetta dalla fiamma e allungare delicatamente la pipetta.</li>
		<li>Tagliare la pipetta allungata al centro con un paio di forbici nella parte A e nella parte B(Figura 3C-E). Utilizzate la parte A come pipetta a punta fine e la parte B come cannula guida. Per aumentare le possibilità di successo dell'intubazione con la cannula guida, fare una smussatura (non troppo affilata che può aumentare il rischio di ferire l'animale) alla fine della parte B(figura 3F). Quando una punta di pipetta a caricamento in gel da 200 μL (per il caricamento della polvere) viene inserita nella cannula guida, deve sporgere la cannula di 1-2 mm. NOTA: Una cannula guida (Parte B) con la dimensione appropriata (diametro interno ed esterno) per l'intubazione potrebbe avere un ago calibro 21 che si adatta al suo interno mentre può anche adattarsi all'interno di un ago calibro 17. Potrebbero essere necessari più tentativi per allungare le pipette per ottenere la quota appropriata.</li>
		<li>(Facoltativo): Tagliare una piccola apertura all'estremità più ampia della cannula guida per renderla più flessibile in modo che sia più facile tenere la fibra ottica (Figura 3F). Questa apertura consente anche il montaggio di un microsprayer per la somministrazione di aerosol liquido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Intubazione
<ol><li>Anestetizzare il topo (BALB/c, 7-9 settimane) con chetamina (100 mg/kg) e xiazina (10 mg/kg) per iniezione intraperitoneale.</li>
	<li>Preparare una piattaforma in plexiglass e montarla su un supporto con un morsetto (Figura 4A). Posizionare il mouse anestetizzato sulla piattaforma (a circa 60° di inclinazione) in posizione supina. L'altezza e l'angolo di inclinazione della piattaforma potrebbero essere regolati dalla posizione del morsetto sul supporto.</li>
	<li>Sospendere il mouse agganciando i suoi incisivi su un filo interdentale di nylon (Figura 4B). Fissare la posizione del mouse con un pezzo di nastro o un elastico.</li>
	<li>Inserire la fibra ottica nella cannula guida prima dell'intubazione con la punta del livello della fibra con l'apertura della cannula guida. Accendere la torcia a LED per illuminare.</li>
	<li>Sporgere delicatamente la lingua del mouse con un paio di forcep per esporre la sua trachea.</li>
	<li>Utilizzare l'altra mano per tenere la cannula guida con fibra ottica all'interno. Inseriscili attraverso la cavità orale. Con l'illuminazione dalla fibra ottica, l'apertura della trachea può essere vista come un orifizio tra le corde vocali.</li>
	<li>Allineare la smussatura della cannula guida verso la linea mediana dell'apertura (Figura 5A). Intubare delicatamente la cannula guida con fibra ottica nella trachea puntando la punta più fine della cannula all'apertura tracheale.</li>
	<li>Al momento dell'intubazione, rimuovere rapidamente la fibra ottica e lasciare la cannula guida all'interno della trachea (Figura 5B). Si deve osservare una respirazione normale.</li>
	<li>Tenere la pipetta a punta fine (parte A) all'apertura della cannula guida e insufflate un piccolo sbuffo d'aria (circa 0,2 mL) nel polmone del topo. Una leggera inflazione nel petto del topo indica una corretta intubazione. Rimuovere la pipetta della punta fine prima della somministrazione della polvere.</li>
</ol>4. Somministrazione di polvere
<ol><li>Tenere la punta caricata in polvere collegata alla siringa come descritto al passaggio 1.5. Assicurarsi che il flusso d'aria tra la siringa e la punta sia scollegato.</li>
	<li>Tirare lo stantuffo della siringa all'indietro per prelevare 0,6 ml di aria. NOTA: Il volume d'aria utilizzato per disperdere la polvere dipende dalle proprietà della polvere e dalla quantità di polvere caricata. Questo è ulteriormente descritto nella sezione dei risultati.</li>
	<li>Ruotare la valvola del fermaflusso a tre vie per collegare il flusso d'aria tra la siringa e la punta carica di polvere.</li>
	<li>Inserire la punta caricata a polvere nella cannula guida che è già stata posizionata nella trachea del mouse (Figura 5C). Tenere la cannula guida e spingere il pistone della siringa con forza in un'azione continua per disperdere la polvere come aerosol nel polmone. NOTA: Qualsiasi movimento in avanti del dispositivo deve essere ridotto al minimo per evitare di ferire l'animale.</li>
	<li>Rimuovere la punta e verificare se la polvere all'interno della punta è stata svuotata. In caso di meno, ripetere il passaggio da 4.1 a 4.4. NOTA: Se la polvere è imballata troppo strettamente a causa di un'eccessiva maschiatura, potrebbe non essere dispersa correttamente.</li>
	<li>Una volta completata la somministrazione, rimuovere la cannula guida dalla trachea.</li>
	<li>Lasciare che il mouse si riprenda posizionandolo orizzontalmente in posizione supina con la lingua semiverotta per evitare il blocco delle vie aeree.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Newman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+to+the+lungs:+challenges+and+opportunities.">Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities.</a> Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).</li><li>Setter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+dry+powder+insulin+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus.">Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus.</a> Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).</li><li>Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. 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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

In questo documento vengono presentati dispositivi su misura per l'insufflazione di polvere secca e l'intubazione intratracheale. Nella fase di caricamento della polvere, la polvere secca viene caricata in una punta di pipetta a caricamento in gel da 200 μL. È importante toccare delicatamente la punta per consentire l'impacchettamento sciolto della polvere all'estremità stretta della punta. Tuttavia, se la polvere è imballata troppo strettamente, rimarrà bloccata nella punta e non può essere adeguatamente dispersa. Si raccomanda di neutralizzare le cariche statiche della polvere e la punta della pipetta al fine di facilitare il carico della polvere, in particolare per la polvere a bassa densità e in bassa umidità relativa. La cannula guida è un componente critico del dispositivo. Viene utilizzato per facilitare l'intubazione della punta della pipetta caricata a polvere nella trachea del mouse. Il diametro della cannula guida non dovrebbe essere troppo largo; altrimenti sarà difficile inserirlo nella trachea e potrebbe ferire il mouse. Il diametro della cannula guida dovrebbe essere abbastanza largo da adattarsi alla fibra ottica e alla punta della pipetta caricata in polvere, e la punta della pipetta dovrebbe sporgere la cannula guida di circa 1-2 mm.
La capacità di visualizzare l'apertura della trachea è fondamentale nel processo di intubazione, consentendo di inserire correttamente la cannula guida. L'apertura tracheale è costituita da cartilagine arytenoide bianca con regolare movimento di apertura e chiusura nella parte posteriore della gola. Con l'illuminazione in fibra ottica, l'apertura della trachea potrebbe essere facilmente visualizzabile. Sbuffando un piccolo volume d'aria attraverso la pipetta di plastica a punta fine, un'inflazione al petto indica una corretta intubazione. Se l'inflazione al petto non viene osservata o la resistenza si sente durante l'inserimento, ritrarre rapidamente la cannula guida e ripetere nuovamente i passaggi.
C'era un insufflator in polvere secca ampiamente disponibile in commercio12,17,18 (Tavolo deimateriali;questo dispositivo è ora fuori produzione). La polvere secca viene caricata nella camera campione del dispositivo e dispersa per aria da una siringa d'aria di plastica da 3 ml o da una pompa dell'aria. Per misurare la dose emessa, il dispositivo deve essere pesato prima e dopo la somministrazione della polvere, il che porta all'imprecisione considerando che la dose di polvere è di solito molto piccola (rispetto alla massa del dispositivo). Rispetto all'insufflator commerciale, il più grande vantaggio del dispositivo su misura è che il successo della dispersione della polvere potrebbe essere osservato dall'assenza di polvere nelle punte trasparenti di pipetta a caricamento in gel. Poiché la punta della pipetta è leggera, può anche essere pesata accuratamente prima e dopo la somministrazione per misurare la dose emessa. La punta della pipetta viene inserita nella cannula guida piuttosto che essere esposta alla trachea dell'animale. C'è un rischio minimo di contaminare la punta con l'umidità o la secrezione nella trachea (che può influire sull'accuratezza della misurazione della dose emessa). Poiché le punte delle pipette sono usa e getta ed economiche, diverse formulazioni di polvere secca possono essere caricate in diverse punte in anticipo. Varie formulazioni possono essere valutate nello stesso esperimento animale senza la necessità di pulizia del dispositivo e di riempimento della dose, risparmiando così tempo ed eliminando il rischio di contaminazione incrociata dalla polvere residua. Inoltre, il modello di dispersione della polvere generato dall'insufflator commerciale variava tra le diverse formulazioni. Diversi studi hanno riferito che la polvere secca dispersa dall'insufflatore commerciale era facilmente agglomerata e non è riuscita a raggiungere ilpolmone profondo al momento della somministrazione 19,20. Al contrario, altre formulazioni disperse da dispositivi simili alla nostra sono segnalate per avere un'alta deposizione polmonare15,21,22.
Ci sono altri dispositivi simili su misura riportati in letteratura per la somministrazione di aerosol in polvere al polmone dell'animale. Ad esempio, Chaurasiya et al. Mentre il loro approccio utilizza attrezzature e materiali standardizzati (ad esempio, otoscopio, cannula e siringa) con meno personalizzazione, il metodo qui offre alcuni vantaggi distinti. In primo luogo, consente la conferma della corretta intubazione prima della somministrazione del farmaco. Questo passaggio è particolarmente utile per gli utenti meno esperti. In secondo luogo, la cannula guida può fungere da scudo protettivo per evitare che qualsiasi secrezione o umidità nella trachea contamini la punta della pipetta a caricamento del gel, consentendo una misurazione della dose emessa più accurata pesando. Infine, la cannula guida più flessibile insieme alla fibra ottica può consentire un'intubazione più semplice.
In sintesi, in questo documento viene introdotto con precisione un insufflatore a polvere secca su misura che è economico, usa e getta, riproducibile ed efficiente nella dispersione di piccole quantità di polvere. Il processo di intubazione menzionato non è invasivo, rapido e potrebbe fornire formulazioni in polvere ai topi in modo sicuro e accurato. Può anche essere adottato per somministrare la formulazione liquida per la consegna polmonare.

La via polmonare di somministrazione offre vari vantaggi nel fornire terapie sia per le azioni locali che sistemiche. Per il trattamento delle malattie polmonari, l'alta concentrazione locale di farmaci può essere ottenuta con l'erogazione polmonare, riducendo così la dose richiesta e abbassando l'incidenza di effetti collaterali sistemici. Inoltre, le attività enzimatiche relativamente basse nel polmone possono ridurre il metabolismo precoce dei farmaci. I polmoni sono anche efficienti per l'assorbimento del farmaco per l'azione sistemica a causa della superficie ampia e ben perfusa, dello strato cellulare epiteliale estremamente sottile e dell'alto volume sanguigno nei capillaripolmonari 1.
Le formulazioni in polvere secca inalato sono state ampiamente studiate per la prevenzione e il trattamento di varie malattie come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, diabete mellito e vaccinazionepolmonare 2,3,4. I farmaci allo stato solido sono generalmente più stabili che nella forma liquida e gli inalatori a polvere secca sono più portatili e facili da usare rispetto ai nebulizzatori5,6. Nello sviluppo di formulazioni in polvere secca inalato, la sicurezza, il profilo farmacocinetico e l'efficacia terapeutica devono essere valutati in modelli animali preclinici dopo somministrazione polmonare7. A differenza degli esseri umani che possono inalare attivamente polvere secca, la consegna polmonare di polvere secca ai piccoli animali è impegnativa. È necessario stabilire un protocollo efficiente per fornire polvere secca ai polmoni degli animali.
I topi sono ampiamente utilizzati come modelli animali da ricerca perché sono economici e si riproducono bene. Sono anche facili da maneggiare e molti modelli di malattia sono ben consolidati. Esistono due approcci principali per somministrare polvere secca al polmone del topo: inalazione e somministrazione intratracheale. Per l'inalazione, il topo viene posto in una camera per tutto il corpo o solo per il naso in cui la polvere secca viene aerosolizzata e gli animali respirano nell'aerosol senza sedazione8,9. Sono necessarie attrezzature costose e l'efficienza di somministrazione dei farmaci è bassa. Mentre la camera di tutto il corpo può essere tecnicamente meno impegnativa, la camera di esposizione solo al naso potrebbe ridurre al minimo l'esposizione dei farmaci alla superficie corporea. Indipendentemente da ciò, è ancora difficile controllare e determinare con precisione la dose somministrata ai polmoni. La polvere secca viene depositata principalmente nella regione del nasofaringe dove lo sgombero mucociliare è prominente10. Inoltre, i topi all'interno della camera sono sotto stress significativo durante il processo di somministrazione perché sono vincolati e privati dell'approvvigionamento di cibo eacqua 11. Per la somministrazione intratracheale, si riferisce generalmente all'introduzione della sostanza direttamente nella trachea. Ci sono due diverse tecniche per raggiungere questo obiettivo: la tracheotomia e l'intubazione orotracheale. Il primo richiede una procedura chirurgica che faccia un'incisione nella trachea, che è invasiva e raramente utilizzata per la somministrazione della polvere. Qui viene descritta solo la seconda tecnica. Rispetto al metodo di inalazione, la somministrazione intratracheale è il metodo più comunemente usato per la consegna polmonare nel topo a causa della sua elevata efficienza di consegna con una perdita minimadi farmaci 12,13. È un metodo semplice e veloce per fornire con precisione una piccola quantità di polvere entro pochi milligrammi al topo. Sebbene il topo sia anatomicamente e fisiologicamente distinto dall'uomo e l'anestesia sia richiesta durante il processo di intubazione, la somministrazione intratracheale aggira le vie respiratorie superiori e offre un modo più efficace per valutare le attività biologiche della formulazione della polvere secca come l'assorbimento polmonare, la biodisponibilità e gli effetti terapeutici14,15.
Per somministrare polvere secca intratrachealmente, il mouse deve essere intubato, il che potrebbe essere impegnativo. In questo documento viene descritta la fabbricazione di un insufflatore di polvere secca su misura e di un dispositivo di intubazione. Vengono dimostrate le procedure di intubazione e insufflazione di polvere secca nel polmone del topo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/c mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap Firefly Luciferase mRNA</td>
			<td>TriLink Biotechnology</td>
			<td>L-7602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Powder Insufflator</td>
			<td>PennCentury</td>
			<td>Model DP-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>Alfasan International B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode (LED) torch</td>
			<td>Unilite Internation</td>
			<td>PS-K1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol (Pearlitol 160C)</td>
			<td>Roquette</td>
			<td>450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-filter round gel loading pipette tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1034-800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon floss</td>
			<td>Reach</td>
			<td>30017050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One milliliter syringe without needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fibre</td>
			<td>Fibre Data</td>
			<td>OMPF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG12KL4 peptide</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td></td>
			<td>(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur fine tip pipette</td>
			<td>Alpha Labotatories</td>
			<td>LW4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcock</td>
			<td>Braun</td>
			<td>D201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Alfasan International B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zerostat 3 anti-static gun</td>
			<td>MILTY</td>
			<td>5036694022153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intratracheal administration of dry powder formulation in mice

Nello sviluppo di formulazioni in polvere secca inalabile, è essenziale valutare le loro attività biologiche in modelli animali preclinici. Questo documento introduce un metodo non invasivo di somministrazione intratracheale della formulazione della polvere secca nei topi. Viene presentato un dispositivo di caricamento a polvere secca costituito da una punta di pipetta di caricamento in gel da 200 μL collegata a una siringa da 1 ml tramite un fermacock a tre vie. Una piccola quantità di polvere secca (1-2 mg) viene caricata nella punta della pipetta e dispersa di 0,6 ml di aria nella siringa. Poiché le punte delle pipette sono usa e getta ed economiche, diverse formulazioni di polvere secca possono essere caricate in diverse punte in anticipo. Varie formulazioni possono essere valutate nello stesso esperimento animale senza pulizia del dispositivo e riempimento della dose, risparmiando così tempo ed eliminando il rischio di contaminazione incrociata dalla polvere residua. L'entità della dispersione della polvere può essere ispezionata dalla quantità di polvere rimanente nella punta della pipetta. È incluso un protocollo di intubazione nel mouse con una sorgente luminosa su misura e una cannula guida. La corretta intubazione è uno dei fattori chiave che influenza l'erogazione intratracheale della formulazione della polvere secca nella regione polmonare profonda del topo.

Quando un insufflatore di polvere secca viene utilizzato per fornire aerosol di polvere al polmone di un animale, il volume d'aria utilizzato è fondamentale in quanto influisce sulla sicurezza e sull'efficienza di dispersione della polvere. Per ottimizzare il metodo, sono stati utilizzati diversi volumi d'aria (0,3 mL, 0,6 mL e 1,0 mL) per disperdere la polvere secca (1 mg di mannito essiccato a spruzzo) e il peso dei topi è stato monitorato per 48 ore dopo lasomministrazione (figura 6). L'uso di 0,3 mL e 0,6 mL di aria non ha causato la perdita di peso dei topi fino a 48 ore dopo la somministrazione. La dispersione della polvere con 1 mL di aria ha comportato oltre il 5% della perdita di peso entro 24 ore, che non è stata completamente recuperata dopo 48 ore. In questo protocollo sono stati utilizzati topi BALB/c di 7-9 settimane. A seconda della specie, del ceppo e dell'età dell'animale, delle proprietà della polvere (ad esempio, distribuzione delle dimensioni delle particelle, coesione e densità) e della massa di polvere da devastare, il volume d'aria da utilizzare per un'efficiente dispersione della polvere e la tolleranza agli animali può richiedere l'ottimizzazione da parte degli investigatori per diversi modelli animali.
La formulazione in polvere secca preparata mediante liofilizzazione a spruzzo (SFD) è stata consegnata ai topi utilizzando il metodo sopra descritto. La formulazione SFD conteneva lo 0,5% dell'mRNA che esprimeva proteine della luciferasi, il 5% del peptide sintetico come vettore di consegna e il 94,5% del mannitol16. I topi BALB/c sono stati somministrati per via intratracheale con 1 mg di polvere di SFD contenente 5 μg di mRNA e l'espressione della luciferasi nei polmoni è stata valutata a 24 ore dopo la somministrazione utilizzando il sistema di imaging in vivo (IVIS)(Figura 7). La polvere di SFD è stata dispersa nell'espressione polmonare profonda e luciferasi. A titolo di confronto, la polvere di SFD è stata ricostituita in PBS (ad un volume finale di 75 μL) e somministrata ai topi come liquido con la stessa procedura di intubazione, ma è stato invece utilizzato un microsprayer per generare aerosol liquido16. L'espressione luciferasi della formulazione ricostituita era significativamente superiore alla formulazione della polvere secca, che potrebbe essere dovuta al problema della dissoluzione della polvere o al diverso profilo farmacocinetico tra polvere e forma liquida. Le caratteristiche istologiche dei polmoni trattati con aerosol di polvere secca di mRNA sono state confrontate con gruppi trattati con il controllo non trattato e il lipopolysaccharide (LPS)(figura 8). I polmoni senza alcun trattamento hanno illustrato una presentazione sana mentre il polmone trattato con 10 μg di LPS intratracheally ha mostrato una distribuzione irregolare dello spazio aereo e infiltrazioni cellulari infiammatorie negli spazi interstiziali e alveolari. I polmoni trattati con polvere di SFD non mostravano segni di infiammazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61469/61469fig01.jpg"> Figura 1: Insufflator a polvere secca su misura. (A) La polvere è imballata vicino all'estremità stretta della punta. (B) Una punta della pipetta a caricamento in gel è collegata a una siringa da 1 ml tramite un fermasolle a tre vie. La cifra è adattata da Liao etal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61469/61469fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61469/61469fig02.jpg"> Figura 2: Sorgente luminosa su misura per l'intubazione. Una fibra ottica flessibile è collegata a una torcia a LED creando un piccolo foro sull'obiettivo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61469/61469fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61469/61469fig03.jpg"> Figura 3: Cannula guida. (A) Una pipetta Pasteur in plastica da 1 mL viene utilizzata per realizzare una cannula guida. (B) La pipetta viene ammorbidita riscaldando. (C) La pipetta riscaldata viene allungata e tagliata. (D) La parte A della pipetta viene utilizzata come pipetta a punta fine. (E&F) La parte B della pipetta viene utilizzata come cannula guida. Viene creata una smussatura per facilitare la procedura di intubazione. Una piccola apertura (opzionale) può essere fatta per aumentare la flessibilità della cannula. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61469/61469fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61469/61469fig04.jpg"> Figura 4: Piattaforma di intubazione. (A) La piattaforma per l'intubazione è costituita da una piastra in plexiglass montata su un supporto. (B) Un topo anestetizzato è posto sulla piattaforma in posizione supina, sospeso agganciando i suoi incisivi con un filo interdentale di nylon. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61469/61469fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61469/61469fig05.jpg"> Figura 5: Diagramma schematico che illustra la procedura di intubazione. (A) La smussatura della cannula guida è allineata con la linea mediana dell'apertura tracheale. (B) La cannula guida viene inserita nella trachea e pronta per la somministrazione della polvere. (C) La punta carica di polvere (collegata alla siringa attraverso un fermaglio a tre linee) è inserita nella cannula guida che è già stata posizionata nella trachea del topo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61469/61469fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61469/61469fig06.jpg"> Figura 6: Somministrazione intratracheale di polvere secca con diverso volume d'aria. I topi BALB/c sono stati somministrati per via intratracheale con polvere di mannitol essiccata a spruzzo (SD) dispersa da 0,3 mL, 0,6 mL e 1,0 mL di aria. Il peso corporeo dei topi è stato monitorato prima della somministrazione e a 18 ore, 24 ore e 48 ore dopo la somministrazione. I dati sono stati presentati come valore medio della percentuale di variazione di peso (n=2). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61469/61469fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61469/61469fig07.jpg"> Figura 7: Somministrazione intratracheale della formulazione dell'mRNA come polvere secca e aerosol liquido ricostituito. I topi BALB/c sono stati somministrati per via intratracheale con la formulazione spray liofilizzato (SFD) allo 0,5% di mRNA (luciferasi) come aerosol in polvere (1 mg) utilizzando insufflatore di polvere secca su misura o aerosol liquido ricostituito (1 mg in 75 μL PBS) utilizzando microsprayer. Ogni topo ha ricevuto una dose di 5 μg di mRNA. Il PBS (75 μL) è stato utilizzato come controllo. A 24 ore dopo la somministrazione (A) i polmoni sono stati isolati per l'imaging a bioluminescenza; (B) sono state misurate l'espressione proteica della luciferasi dei tessuti polmonari. I dati sono stati espressi come valore medio dell'unità di luce relativa (RLU) per mg di proteina, analizzato da ANOVA uni-way seguito dal test post-hoc di Tukey, ***p < 0,001 (n=4). La figura è adattata da Qiu etal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61469/61469fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61469/61469fig08.jpg"> Figura 8: Istologia dei polmoni dei topi dopo somministrazione intratracheale della formulazione di mRNA in polvere secca. (A) controllo non trattato; i topi sono stati somministrati per via intratracheale con (B) LPS (10 mg in 25 μL PBS) e (C) polvere di mRNA liofilizzato spray (1 mg). Le diapositive venivano visualizzate utilizzando un microscopio verticale con ingrandimento 20x (barra di scala = 100 mm). La figura è adattata da Qiu etal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61469/61469fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

Le formulazioni in polvere secca per inalazione hanno un grande potenziale nel trattamento delle malattie respiratorie. Prima di entrare in studi sull'uomo, è necessario valutare l'efficacia della formulazione della polvere secca in studi preclinici. Viene presentato un metodo semplice e non invasivo per la somministrazione di polvere secca nei topi attraverso la via intratracheale.

Somministrazione intratracheale della formulazione di polvere secca nei topi

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K Views.  The University of Hong Kong. Le formulazioni in polvere secca per inalazione hanno un grande potenziale nel trattamento delle malattie respiratorie. Prima di entrare in studi sull'uomo, è necessario valutare l'efficacia della formulazione della polvere secca in studi preclinici. Viene presentato un metodo semplice e non invasivo per la somministrazione di polvere secca nei topi attraverso la via intratracheale.

Video: Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose concentrations, even in non-diabetic patients, predicts poor outcomes.1-4 The 2008 consensus statement by the American Association of Clinical Endocrinologists (AACE) and the American Diabetes Association (ADA) states that "hyperglycemia in hospitalized patients, irrespective of its cause, is unequivocally associated with adverse outcomes."5 It is important to recognize that hyperglycemia occurs in patients with known or undiagnosed diabetes as well as during acute illness in those with previously normal glucose tolerance.
The Normoglycemia in Intensive Care Evaluation-Survival Using Glucose Algorithm Regulation (NICE-SUGAR) study involved over six thousand adult intensive care unit (ICU) patients who were randomized to intensive glucose control or conventional glucose control.6 Surprisingly, this trial found that intensive glucose control increased the risk of mortality by 14% (odds ratio, 1.14; p=0.02). In addition, there was an increased prevalence of severe hypoglycemia in the intensive control group compared with the conventional control group (6.8% vs. 0.5%, respectively; p&lt;0.001). From this pivotal trial and two others,7,8 Wyoming Medical Center (WMC) realized the importance of controlling hyperglycemia in the hospitalized patient while avoiding the negative impact of resultant hypoglycemia. 
Despite multiple revisions of an IV insulin paper protocol, analysis of data from usage of the paper protocol at WMC shows that in terms of achieving normoglycemia while minimizing hypoglycemia, results were suboptimal. Therefore, through a systematical implementation plan, monitoring of patient blood glucose levels was switched from using a paper IV insulin protocol to a computerized glucose management system. By comparing blood glucose levels using the paper protocol to that of the computerized system, it was determined, that overall, the computerized glucose management system resulted in more rapid and tighter glucose control than the traditional paper protocol. Specifically, a substantial increase in the time spent within the target blood glucose concentration range, as well as a decrease in the prevalence of severe hypoglycemia (BG &lt; 40 mg/dL), clinical hypoglycemia (BG &lt; 70 mg/dL), and hyperglycemia (BG &gt; 180 mg/dL), was witnessed in the first five months after implementation of the computerized glucose management system. The computerized system achieved target concentrations in greater than 75% of all readings while minimizing the risk of hypoglycemia. The prevalence of hypoglycemia (BG &lt; 70 mg/dL) with the use of the computer glucose management system was well under 1%.

When compared to the previous paper protocol, implementation of a computerized glucose management system results in a substantial increase in blood glucose concentration measurements within the target range. Using a computerized glucose management system to monitor blood glucose levels, decreases in severe hypoglycemia (&lt;40 mg/dL), clinical hypoglycemia (&lt;70 mg/dL), and hyperglycemia (&gt;180 mg/dL) also can be observed.

Migliorare La somministrazione di insulina IV in un ospedale di comunità

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

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Medicina

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

Somministrazione intranasale di terapeutica del sistema nervoso centrale di topi Awake

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusi carotide di farmacocinetica e di farmacodinamica Analisi dei taxani nei topi

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarteriosa somministrazione di oncolitici virus per locoregionale Terapia delle ortotopico HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and bronchodilator drugs. Despite the availability of multiple treatments, both diseases are growing public health concerns. The majority of asthma patients are well controlled on current inhaled therapies but a substantial number of patients with severe asthma are not. Asthma affects an estimated 300 million people worldwide and approximately 20 percent have a severe form of the disease. In contrast to asthma, there are few effective therapies for COPD. An estimated 10% of the population has COPD and the trend in death rates is increasing for COPD while decreasing for other major diseases. Although developing drugs for inhaled delivery is challenging, the nose-only inhalation unit enables direct delivery of novel drugs to the lung of rodents for pre-clinical efficacy and safety/toxicology studies. Inhaled drug delivery has multiple advantages for respiratory diseases, where high concentration in the lung improves efficacy and minimizes systemic side effects. Inhaled corticosteroids and bronchodilators benefit from these advantages and inhaled delivery may also hold potential for future biologic therapies. The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs of rodents, key data required before initiating clinical development.

The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs; key data enabling clinical inhaled drug development.

Polvere secca e nebulizzata Aerosol L&#39;inalazione di prodotti farmaceutici distribuito nelle topo, utilizzando un naso-only Sistema di esposizione

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study these pulmonary diseases. Previous pleural effusion models paid more attention to biological factors rather than nanoparticles in the environment. Here, we introduce a model to make pleural effusion in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica, and a method of nanoparticle isolation in the pleural effusion. By intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica with concentrations of 3.125, 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL, the pleural effusion in rats presented on day 3, peaked at days 7-10 in 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL groups, then slowly decreased and disappeared on day 14. When the concentration of polyacrylate/nanosilica increased, the pleural effusion is produced more and faster. This pleural fluid was detected by ultrasound examination or CT chest scanning and confirmed by dissection of rats. Silica nanoparticles were observed in the rats' pleural effusion by transmission electron microscope. These results showed that the exposure to polyacrylate/nanosilica leads to the induction of pleural effusion, which was consistent with our previous report in humans. Additionally, this model is beneficial for the further study of nanotoxicology and the pleural effusion diseases.

Here, we present a protocol to construct a pleural effusion model in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica.

Un modello di effusione pleurica in ratti mediante instillazione intratracheale di poliacrilato/nanosilice

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Istituzione di un modello di occhio secco severo utilizzando la dacrigofectomia completa nei conigli

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...