Questa tecnica ci consente di raccogliere popolazioni di worm su larga scala da utilizzare per più piattaforme omiche con manipolazione minima. Questa tecnica ci permette di raccogliere popolazioni di C.elegans a fase mista attraverso più esperimenti omici per ottenere un quadro olistico di ogni campione. Per individuare lo sbiancamento degli adulti gravidi su lastre di coltura su larga scala, fiammare un verme raccogliere su un bruciatore Bunsen e utilizzare il piccone per raccogliere E.coli fresco dal bordo del prato batterico su una piastra di coltura su larga scala.
Scegli un singolo adulto gravid dalla quarta piastra del pezzo per lo sbiancamento spot e aggiungi cinque microlitri di soluzione di ipoclorito alcalino appena preparata in un angolo della piastra di coltura su larga scala lontano dal prato E.coli. Posizionare l'adulto gravide nella soluzione alcalina di ipoclorito e toccare il nematode per interrompere la cuticola e rilasciare le uova. Quando un totale di cinque adulti sono stati posizionati uniformemente intorno al prato E.coli nello stesso modo, riposizionare il coperchio sul piatto.
Per raccogliere campioni da piastre di coltura su larga scala, versare 50 millilitri di soluzione M9 su una superficie di lamiera di coltura su larga scala e ruotare la piastra per assicurarsi che l'M9 copra l'intera superficie di agarosio medio di crescita del nematode. Innescare una pipetta sierologica sterile con M9 e inclinare la piastra in modo che la popolazione di M9 e vermi si riunisca in un angolo della piastra. Utilizzare la pipetta innescata per aspirare la sospensione del verme e aggiungere i vermi a un tubo conico da 50 millilitri.
Posizionare il tubo su un rocker per interrompere eventuali ciuffi batterici e detriti. Quando tutti i vermi sono stati raccolti da tutte e tre le piastre, trasferire 15 millilitri di vermi da ogni tubo in ciascuno dei tre tubi conici da 15 millilitri e sedimentare i vermi nei tubi mediante centrifugazione. Aspirare con cura i supernatanti senza disturbare i pellet di verme e aggiungere 13 millilitri di sospensione del verme ad ogni tubo.
Invertire i tubi per rimorsi i pellet e lavare via il maggior quantità possibile di batteri e detriti e centrifugare nuovamente i vermi. Quando ogni intera popolazione di vermi è stata raccolta, lavare il pellet di verme tre volte in 10 millilitri di soluzione M9 fresca per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimorsi di ogni pellet di verme pulito in 10 millilitri di acqua distillata doppia.
Per la stima delle dimensioni della popolazione, diluire rapidamente tre aliquote di 100 microlitri di campione di verme da ciascun tubo in 900 microlitri di soluzione M9 per campione e utilizzare le aliquote per effettuare diluizioni seriali. Posizionare le sospensioni del campione di verme stock su un rocker per il movimento continuo delle colture mentre le aliquote vengono conteggiate e mescolare le diluizioni del verme fino a quando non sono omogenee. Aggiungere cinque microlitri di soluzione dal primo al campione di 10 worm a uno scivolo al microscopio di vetro e contare i vermi per microscopia leggera.
Se nel campione sono presente meno di 50 worm, contare le diluizioni 1:100 e 1:1.000. Se sono disponibili più di 50 worm, passare alla successiva diluizione seriale. Dopo aver contato ogni replica aliquota di ogni diluizione tre volte, la media conta la diluizione per determinare la dimensione stimata della popolazione del verme.
Quindi dividere i campioni di verme nelle aliquote sperimentali appropriate e congelare i campioni in azoto liquido per meno 80 gradi Celsius. Per preparare un campione di verme per la citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni, diluire un'aliquota del verme a stadio misto circa cinque volte 10 a un volume finale di 10 millilitri di soluzione M9 e aggiungere 200 microlitri di un milligrammo per millilitro E.coli e 1:50 diluizione della soluzione di micromolar rosso fluorescente micromolarmente alla sospensione del verme. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente con dondolo, raccogliere i vermi e le microsfere mediante centrifugazione e lavare i vermi due volte con una fresca soluzione M9 per rimuovere eventuali batteri in eccesso e microsfere non internalizzate.
Dopo il secondo lavaggio, rimorsi il pellet in cinque millilitri di soluzione M9. Se il pellet sembra pulito, aggiungere cinque millilitri di M9 integrati con azide di sodio da 50 millimolare ai vermi e posizionare il tubo su un rocker per raddrizzare ed eutanasiare i vermi per un conteggio e un dimensionamento accurati. Per la documentazione sulla distribuzione della popolazione, aprire il modello di piastra calibrato a 384 pozzi e impostare il modello in modo da distribuire 20 oggetti recintato in quattro pozzi per ottenere quattro repliche tecniche di ogni regione recintata per ciascuna delle 20 regioni bar del campione.
Caricare un campione di vermi da 40 millilitri sul citometro a flusso di particelle di grandi dimensioni e iniziare a ordinare automaticamente il campione mescolando continuamente il campione per evitare di depositare e erogare contemporaneamente oggetti dal campione nella piastra calibrata a 384 pozzetti. Una volta che l'intero campione è stato ordinato e il numero massimo di regioni recintato è stato erogato nella piastra da 384 pozzi, rimuovere il campione dal citometro e pulire lo strumento. Il metodo della piastra di coltura su larga scala è stato testato su 15 ceppi di C.Elegans, tra cui una miscela di mutanti del Caenorhabditis Genetics Center e ceppi selvatici di Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource.
In questa analisi, il metodo della piastra di coltura su larga scala ha prodotto dimensioni della popolazione da circa 94.500 a 9.290.000. La dimensione media della popolazione all'interno del ceppo di riferimento PD1074 e tra i ceppi era di circa 2,4 milioni di vermi. Non sono state riscontrate differenze significative nelle dimensioni stimate della popolazione tra i ceppi di C.elegans nel corso di una media di 12,2 giorni di crescita su larga scala.
Le piastre di coltura su larga scala PD1074 hanno impiegato tra i 10 e i 14 giorni per crescere fino a raggiungere una popolazione a fasi miste con un tempo di crescita medio di 12,2 giorni. La tensione in crescita più lenta è cresciuta per un massimo di 20 giorni e la varietà in più rapida crescita è cresciuta per un minimo di 10 giorni. In questa distribuzione del campione per PD1074, i vermi sono stati misurati dallo stadio L1 attraverso adulti gravidi su un grande citometro a flusso di particelle.
Successive immagini e visualizzazioni delle variazioni nella distribuzione della popolazione tra i campioni hanno rivelato che la pipeline ha generato una popolazione mista di C.elegans. È importante contare accuratamente i worm durante la raccolta di campioni in modo da ottenere dati comparabili tra le crescita e gli studi. Questo approccio di raccolta può essere applicato al sequenziamento dell'RNA, alla genomica e ad altre analisi omiche per espandere la nostra comprensione delle complicate dinamiche che si verificano all'interno delle popolazioni C.elegans.
Questa tecnica ci consente di raccogliere popolazioni miste di C.elegans in più esperimenti omici per ottenere un quadro olistico di ogni campione.
