Questo studio è stato sostenuto dal Research Institute del Texas (CPRIT) premio RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 e la prevenzione di cancro e dell'istituti nazionali di salute K22 AI110552 assegnato a NVK. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

<ol>
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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine,+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa,+translocates+into+C.+elegans,+removes+iron,+and+activates+a+distinct+host+response.">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa.">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li><li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation.">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li><li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans.">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse a divulgare.

Questo saggio (o simili saggi dove altri agenti patogeni vengono sostituiti con p. aeruginosa o E. faecalis) sono utile per una varietà di scopi, tra cui la scoperta di nuovi farmaci. È anche utile per affrontare questioni biologiche fondamentali, come identificare i fattori di virulenza, la delucidazione dei meccanismi di difesa ospite e determinare il regolamentazione macchinari coinvolti nell'interazione ospite-patogeno.
Anche se il dosaggio di uccisione liquido p. aeruginosa è robusto, ci sono diversi punti dove l'attenzione attenta dovrebbe essere pagata per minimizzare la probabilità di guasto. In primo luogo, come già fatto notare, la piastra di origine batterica per p. aeruginosa vaccinazioni deve rimanere fresca, per timore che i batteri perdono virulenza, nonostante la crescita durante la notte in LB. In secondo luogo, è chiave per assicurarsi che il calcio e magnesio sono aggiunti a p. aeruginosa uccidendo saggi. Senza di essa, virulenza sarà significativamente compromessa. Infine, vale la pena notare che vermi allevati su HT115 (per le analisi basate su RNAi) morirà significativamente più successivamente di vermi allevati su OP50 (N. Kirienko, comunicazione personale). Per questo motivo, se passando a studi basati su RNAi, è importante determinare empiricamente il miglior punto di tempo per il dosaggio.
Per l'uccisione di saggi con p. aeruginosa o E. faecalis, è fondamentale per garantire un'alimentazione adeguata per lo sviluppo dei vermi dalla fase L1 fino a quando non sono pronti per essere utilizzati nel test. Fame, anche nel breve periodo, è noto per attivare un numero di vie di difesa ospite, quali l'insulina/IGF di DAF-2/DAF-16 segnalazione rete27. I nostri dati suggeriscono che DAF-16/FOXO è già leggermente attivato da essere coltivate in liquido20, e ulteriore attivazione è fortemente auspicabile, poiché DAF-16/FOXO promuove patogeno ad ampio spettro resistenza23.
Infine, è fondamentale utilizzare completamente sterile vermi in qualsiasi test che si basa sulla mortalità come una lettura. Se i vermi sono fertili, essendo in liquido provoca difficoltà di deposizione delle uova. Di conseguenza, alcuni degli embrioni si schiudono all'interno del padre, alla fine causando la sua morte. Per questo motivo, generalmente usiamo una lesione genetica, come glp-4(bn2)28, che dimostra un fenotipo completamente penetrante sterile per queste analisi. L'uso di sostanze chimiche che impediscono lo sviluppo embrionale ma consentire comunque la deposizione delle uova, ad esempio 5-fluorodeossiuridina (FUdR), dovrebbe essere evitato come essi possono anche interferire con lo sviluppo e la crescita batterica.
In generale, abbiamo trovato molto utile per pianificare parecchi punti di tempo per l'analisi. Anche se il dosaggio è robusto e la tempistica è generalmente coerente, stocastici e impercettibili cambiamenti è in grado di spostare il momento della morte nell'analisi entro 2-4 ore. Quando è necessaria la risoluzione dei problemi, spesso è utile prendere in considerazione in primo luogo la più semplice delle risposte; cioè, preparare supporti freschi, scartare le colture batteriche più recente e ri-rigare ceppi batterici dal scorte congelate, ecc solo molto raramente queste misure non ripristinare il test di funzionalità.
Dovuto la relativa semplicità del metodo, un'ampia varietà di modifiche può essere facilmente eseguita. Cambiando i vermi da uno sfondo uniforme glp-4(bn2) per gli schermi di RNAi di alto-rendimento, come quelli Descriviamo qui, è utile per l'identificazione delle vie di risposta di host per una vasta gamma di xenobiotici e sostanze chimiche tossiche. Ad esempio, aggiungendo la stessa sostanza chimica o tossina in tutti i pozzetti di piastre di RNAi (ad es., Cry5B tossina, fenantrolina, ecc.), le vie che alterano la sensibilità a queste tossine possono essere facilmente identificate. Questi tipi di schermi è utilizzabile anche per identificare le reti di difesa contro qualsiasi della panoplia di agenti patogeni che infettano c. elegans.

L'identificazione e lo sviluppo di efficaci antibiotici ad ampio spettro, ora quasi un secolo fa, ha portato a un momento di svolta nella sanità pubblica dove c'era una credenza diffusa che infettiva malattia sarebbe un flagello del passato. Entro pochi decenni, questo ottimismo iniziò a scemare, come agente patogeno dopo agente patogeno ha sviluppato meccanismi di resistenza che limitato questi trattamenti una volta miracolosi. Per qualche tempo, la corsa agli armamenti tra azioni di individuazione di droga e gli agenti patogeni sembrava equilibrata. Tuttavia, l'uso improprio degli antimicrobici è recentemente culminato nell'emergere di ceppi di Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescense p. aeruginosa1, pan-farmaco resistenti 2,3,4.
P. aeruginosa è un patogeno di negativo, multi-host di grammo di opportunisti, che è una grave minaccia ai pazienti con gravi ustioni, coloro che sono immunocompromessi, o hanno la fibrosi cistica. È inoltre sempre più identificato come un agente eziologico nelle infezioni nosocomial severa, particolarmente dovuto la sua acquisizione in corso della resistenza antimicrobica. Per cominciare ad affrontare questa minaccia, abbiamo usato la ben documentata elegans del c.-p. aeruginosa infezione sistema5. Il nostro laboratorio ha sfruttato questo sistema per sviluppare una piattaforma di base liquida, ad alta velocità, ad alto contenuto di screening per identificare nuove molecole che limitano la capacità del patogeno di uccidere l' host6. Curiosamente, questi composti sembrano appartenere ad almeno tre categorie generali, compresi gli antimicrobici7 e virulenza inibitori8. Altri saggi di scoperta di droga ad alto contenuto in c. elegans sono stati segnalati per del micobatterio tuberculosum, Chlamydia trachomatis, pestis di Yersinia, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Enterococcus faecalis, tra gli altri9,10,11,12,13,14,15,16. Questi tipi di analisi presentano parecchi vantaggi ben riconosciuti, ad esempio limitando falsi positivi successi che possono essere tossici per sia l'host e l'agente patogeno, probabilità aumentata della biodisponibilità rispetto a uno schermo di chimico e la capacità di identificare successi di là semplicemente limitando la crescita microbica, come anti-virulents, stimolatore immunitario molecole o composti che altrimenti inclinare la bilancia dell'interazione ospite-patogeno in favore della ex. Inoltre, i composti scoperti in queste schermate sono spesso efficaci in mammiferi padroni di casa.
Vale la pena notare che almeno due altri saggi17,18 sono disponibili per realizzare schermi di alto-rendimento in c. elegans in liquido. Tuttavia, ciascuno di questi test è una modifica che permette il dosaggio di colonizzazione intestinale prototipo, conosciuto come lento-uccisione, da eseguirsi in liquido, aumentando la produttività e consentendo di composti più facilmente essere schermato. Un'attenta caratterizzazione ha dimostrato conclusivamente che i meccanismi di virulenza batterica sono diversi tra questi saggi e nostra base liquida schermo7. Poiché entrambi i tipi di virulenza sono osservati nei sistemi mammiferi, è importante considerare quali determinanti di virulenza sono più rilevante per gli interessi dello sperimentatore prima della selezione di test.
Qui dimostriamo una versione ottimizzata del liquido basato su analisi di c. elegans-P. aeruginosa . Segnaliamo anche l'adattamento del nostro metodo di analisi liquido-basata per ospitare l'agente patogeno batterico gram-positivo Enterococcus faecalis. Come p. aeruginosa, E. faecalis è sempre più identificato come una minaccia seria nosocomial con un armamento crescente di resistenza antimicrobica vie1. Anche se esiste un metodo precedente per high throughput screening di E. faecalis 14, richiede preinfection con l'agente patogeno, che complica la procedura e aumenta la probabilità di contaminazione di attrezzature come il FlowSort COPAS. Il nostro protocollo Elimina la necessità di pre-infezione, miglioramento del profilo di sicurezza. Infine, segnaliamo un mezzo mediante il quale uno di questi test possono essere combinato con alimentazione di RNAi, permettendo all'utente di cercare per fattori ospite che giocano un ruolo nella creazione di, o resistenza a, infezione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>COPAS FP BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>Large object flow cytometer/worm sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL406 Washer Dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Deep-Well RB Block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>MPG-781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Media (NGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow Killing (SK) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow Killing (SK) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter:&#160; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>L1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>50-488-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Bleach Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S Basal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>S5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>P3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>P5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td>
			<td>BICCA</td>
			<td>7495.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P. aeruginosa (PA14)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. faecalis(OG1RF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli superfood (OP50)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Strains </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

Il numero di nuovi farmaci identificati da tradizionale, schermi in vitro è scemato, riducendo il successo di questo approccio nella ricerca di nuove armi combattere la Resistenza multifarmaco. Questo ha portato alla conclusione che i ricercatori non solo la necessità di trovare nuovi farmaci, ma anche bisogno di sviluppare nuovi modi di trovare loro. Tra i candidati più promettenti metodi sono intero-organismo, in vivo dosaggi che uso alto-rendimento, fenotipica letture e ospita che vanno da Caenorhabditis elegans di Danio rerio. Questi host presentano parecchi vantaggi potenti, tra cui le riduzioni drammatiche in falsi positivi colpisce, come composti che sono tossici per l'ospite e/o biounavailable vengono in genere eliminati nella schermata iniziale, prima di seguire costosi fino.
Qui vi mostriamo come nostra analisi sono stato utilizzato per interrogare variazione host la ben documentata di c. elegans— patosistema come contributo liquido uccisione diPseudomonas aeruginosa . Inoltre dimostriamo diverse estensioni di questa tecnica ben lavorata fuori. Per esempio, siamo in grado di svolgere high throughput genetiche schermate mediante RNAi in 24 o 96 pozzetti formati piastra di fattori dell'ospite query in questa interazione ospite-patogeno. Usando questa analisi, schermi intero genoma possono essere completati in pochi mesi, che possono di semplificare notevolmente il compito di individuare bersagli farmacologici, potenzialmente senza la necessità di approcci biochimici laboriosa purificazione.
Inoltre segnaliamo qui una variazione del nostro metodo che sostituisce il batterio gram-positivo Enterococcus faecalis per l'agente patogeno gram-negativo p. aeruginosa. Molto come è il caso per p. aeruginosa, uccisione di E. faecalis è dipendente dal tempo. A differenza del precedente c. elegans— saggi diE. faecalis , nostra analisi per E. faecalis non richiede preinfection, migliorando il suo profilo di sicurezza e riducendo le possibilità di contaminazione liquido-per la movimentazione. Il dosaggio è estremamente robusto, mostrando ~ 95% tassi di mortalità 96h post infezione.

Parametri importanti per le prestazioni
Una corretta comprensione della biologia alla base di questa analisi è necessaria per risolvere i problemi e ottimizzare il dosaggio. A tal fine, ci riferiamo in primo luogo a parecchie carte chiave delucidamento dei meccanismi di patogenesi di p. aeruginosa-mediata uccidendo in liquido7,20. Condizione che i passaggi descritti sopra sono seguiti (vedere la Figura 1 per lo schema di protocollo di analisi) una dipendente dal tempo di uccisione di c. elegans sarà osservata solo in presenza del patogeno (Figura 2A). Al contrario, in assenza di chiavi supplementi nutrizionali (ad esempio, se il peptone viene lasciato fuori dalla media, e viene aggiunto solo S basale), poco o nessun omicidio verrà osservato (Figura 2B). Interessante, l'incubazione in due fasi di p. aeruginosa (per 24 ore a 37 ° C, allora 24 h a 25 ° C) che è fondamentale per le analisi di lento-uccisione convenzionale ed era originariamente implementato in liquido uccidendo21, è superfluo in questo dosaggio ( Figura 2). Mentre è possibile aggiungere p. aeruginosa direttamente dalla cultura LB durante la notte, facendo così in modo significativo cambia la cinetica di letalità e non è raccomandato.
Comprensione della biologia di analisi consente anche la semplificazione del test, se opportuno e auspicabile. Ad esempio, il driver più importante dell'host uccidendo in questo saggio è il sideroforo pioverdina e tossicità ospite causata da pioverdina è subordinato alla sua capacità di legare il ferro7. Come tale, il dosaggio può essere semplificato sostituendo pioverdina ricchi filtrato, pioverdina purificato o anche qualche ferro-chelante prodotti chimici sintetici (ad es., 1,10-fenantrolina) per batteri vivi, come la risposta trascrizionale di c. elegans a questi trattamenti è molto simile (Figura 3)22.
Diverse linee di evidenza parlano alla robustezza dell'apparato sperimentale. In primo luogo, il programma di installazione tollera una vasta gamma di concentrazioni batteriche iniziale. Concentrazioni basse quanto OD600 = 0.0025 (circa 10 volte inferiore di quella raccomandata) ancora esibire uccisione tempo e concentrazione-dipendente, anche se i tempi di spostamento (Figura 4A). In secondo luogo, la riproducibilità del dosaggio è tale che come pochi come 4 pozzi è spesso sufficiente per ottenere dati statisticamente significativi (Figura 4B).
Ci sono diverse modifiche che non è consigliabile. Ad esempio, utilizzando inoculi di batteri iniziale con concentrazioni molto superiori a quelli elencati nel protocollo; Questa operazione genera spesso, biofilm-come materiale che è difficile o impossibile per lavare in modo efficace, che complica la letalità notante. Inoltre, alta concentrazione batterici inoculi anche possono competere per ossigeno e innescare non specifico host uccisione7.
Un'altra nota importante è limitare il periodo di tempo tra arrestando il dosaggio e i vermi morti di imaging. Si noti che questo lasso di tempo deve includere colorazione, pertanto è fondamentale per essere efficiente. Dopo la morte, il materiale biologico all'interno di vermi comincia ad estrudere e/o essere consumato da batteri. Nel giro di 24-32 h, rimane solo la cuticola. La cuticola macchie molto male ed è molto leggera, che lo rende facile da perdere durante i lavaggi. È importante notare che ceppi o ceppo/RNAi condizioni con molto diversa cinetica di uccisione possono essere complicate da questo fenomeno (cioè, alcuni vermi potrebbero essere ancora vivi mentre gli altri hanno già perso il loro contenuto e sono impossibili da immagine). Figura 4A Mostra questo fenomeno, come vermi sul lato sinistro della piastra, inoculato con concentrazioni molto basse di batteriche iniziale, sono ancora in gran parte viva mentre vermi sul lato destro della piastra, che sono stati esposti a concentrazioni molto più elevate di batteri, sono stati mondati.
Un determinante importante del successo di dosaggio è il metodo utilizzato per raccogliere e analizzare i dati. Nel nostro laboratorio, abbiamo usato almeno tre metodi per la raccolta dati da queste analisi: spettrofotometria, microscopia automatizzata e flusso vermimetry (cioè, l'adattamento delle tecniche di citometria a flusso di c. elegans; letteralmente, la misurazione di vermi in una soluzione che scorre). Il primo di questi metodi utilizza un spectophotometer per leggere la fluorescenza della tintura o reporter dei vermi in questione. Questo metodo ha il vantaggio di utilizzare un pezzo abbastanza onnipresente di attrezzature (uno spettrofotometro standard con un lettore di micropiastre) ed è il metodo più veloce per acquisire dati. Tuttavia, manca il contenuto informativo disponibile in microscopia automatizzata e il potere statistico di flusso vermimetry.
Microscopia automatizzata è un'altra valida opzione. Un numero di sistemi di imaging micropiastra è attualmente sul mercato, che vanno a prezzi che sono accessibili a un singolo investigatore (ad es., un Cytation5 di Bio-Tek) ai più grandi, più costosi e macchine di qualità superiore che più comunemente si trovano nel nucleo strutture (ad es., un microscopio di ImageXpress dispositivi molecolari). In pratica, la maggior parte di queste soluzioni sono favorevole per il punteggio più schermi e saggi. Più piattaforme imaging automatizzati possono anche essere accoppiati a valle software per elaborazione delle immagini (ad es., MetaMorph, ImageJ, Gene5 o Cell Profiler) per ulteriormente la resa delle informazioni. Esempi dell'utilità di elaborazione sono mostrati in Figura 5 e Figura 6. Quando il rapporto segnale-rumore è alto (come in Figura 5), l'analisi è semplice e discriminare tra condizioni positive e negative è banale. In questi casi, anche deboli colpi possono essere facilmente identificati. Molti saggi, tuttavia, hanno un rapporto segnale-rumore più debole. Ad esempio, il trattamento delle viti senza fine22 rosa-1::GFP (con l'espressione costitutiva mCherry nella loro pharynges) con 1,10-phenathroline aumenta il livello di rosa-1::GFP. Per l'analisi dei dati, il reporter GFP inducibile è normalizzato al segnale mCherry costitutiva (Figura 6). In questo caso, il reporter ha più debole espressione e/o non è attivato nella maggior parte dei vermi. Di conseguenza, l'implementazione di ulteriori strumenti elaborazione delle immagini, come cellula Profiler, che possono ridurre la priorità bassa e amplificare il segnale può essere vantaggioso.
Infine, se un FlowPilot COPAS è disponibile, può essere utilizzato per acquisire i dati tramite flusso vermimetry. Molto simile al concetto più familiare di citometria a flusso, questo strumento può essere utilizzato per misurare la fluorescenza di c. elegans in almeno due o tre canali alla volta. Questo metodo è molto favorevole per l'acquisizione dei dati con alta significatività statistica, ma la velocità effettiva è molto diminuita rispetto alla microscopia automatizzata. Il vantaggio più significativo di flusso vermimetry è nella capacità di analizzare le popolazioni di intere vite senza fine come un unico gruppo per una replica, anziché dividendoli in pozzi multipli e analizzando la media dei pozzetti. Analisi dei grandi gruppi in questo modo drasticamente migliora la potenza statistica e consente di rilevare anche piccoli effetti.
Modifiche del dosaggio liquido uccisione
Recenti sviluppi del dosaggio hanno esteso la sua utilità includendo analizzante attivazione di reporter fluorescenti (Figura 6), utilizzando tecniche di medio-alto rendimento RNAi (Figura 3) e anche la sostituzione dell'originale agente patogeno.
Il motivo più ovvio utilizzare RNAi istituito è quello di testare per le vie di difesa ospite contro p. aeruginosa (o altri agenti patogeni). Esempi di RNAi atterramento di geni rilevanti per la sopravvivenza nell'analisi sono mostrati nella Figura 3. Coerente con precedenti osservazioni20,23,24,25, daf-2(RNAi) migliorata sopravvivenza di c. elegans durante l'esposizione di p. aeruginosa, mentre daf-16 ( RNAi), zip-2(RNAi) e cebp-1(RNAi) ridotto. Come notato, RNAi è più semplicemente incluso nell'analisi della crescita vermi sulle piastre multipozzetto dove ciascun pozzetto contiene un altro clone di RNAi. A causa l'elevata viscosità del agar e piccoli volumi coinvolti, è difficile ottenere un riempimento uniforme, privo di bolle di piastre da 96 pozzetti senza attrezzature specializzate. Inoltre, i ceppi batterici che trasportano il RNAi di essiccazione anche può essere un problema, come i pozzetti esterni asciugano più velocemente di pozzi interne, che conduce al potenziale non-uniformità e significativo per il cracking di agar. Come notato sopra, questo incoraggia vermi alla tana, riducendo il numero di animali disponibili per lo screening e rischi di intasamento movimentazione del liquido. Per entrambi questi motivi, piastre da 24 pozzetti sono più facili da lavorare con più piastre da 96 pozzetti. Anche se questo riduce la velocità effettiva di dosaggio, migliora l'affidabilità ed è suggerito, in particolare per le schermate iniziali.
Infine, il dosaggio è stato modificato il dosaggio per sostituire p. aeruginosa con E. faecalis. (In linea di principio, sostituzione con altre specie batteriche non dovrebbe fornire indebite difficoltà, purché le condizioni di esposizione e di coltura appropriati sono identificate.) Il fattore più importante da considerare è i requisiti di media dell'agente patogeno, sia per la crescita e lo sviluppo e per l'induzione della virulenza. Ad esempio, il Gram positivo, opportunistico patogeno E. faecalis richiede media ricchi di nutrienti (come BHI) e l'incubazione a temperature più elevate rispetto a p. aeruginosa14,26. Prendendo questi fattori in considerazione, adattamento del dosaggio da utilizzare E. faecalis è stato semplice. Come osservato per p. aeruginosa, abbiamo visto uccisione tempo-dipendente (Figura 7). È interessante notare che, il momento della morte era simile a saggi pubblicati in precedenza che utilizzato pre-infezione su piastre agar26, nonostante l'assenza di questo passaggio, che può suggerire che i meccanismi coinvolti nella patogenesi variano.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig1.jpg"> Figura 1: schema per liquido a base di c. elegans – analisi di p. aeruginosa infezione. Passaggi riguardanti la preparazione e la propagazione del nematode sono sul lato sinistro, preparazione batterica sono a destra. Passaggi riguardanti entrambi sono centrati. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58068/58068fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig2.jpg"> Figura 2: Uccisione di c. elegans da p. aeruginosa è specifico e richiede una corretta alimentazione batterica. (A) c. elegans morte in presenza di Escherichia coli e di p. aeruginosa. (B) morte di c. elegans in presenza di p. aeruginosa con (a destra) e senza (sinistra) media di uccidere lento aggiunto per mescolare (cioè, S solo basale). S basale è un minimo di media e non contiene le sostanze nutrienti richieste per la crescita batterica e impedisce la produzione di pioverdina. (C) c. elegans morte in presenza di diversamente preparato p. aeruginosa. p < 0.01, basato su t di Student-test. Barre di errore rappresentano s.e.m. 10 pozzi sono stati utilizzati per replica biologico a condizione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58068/58068fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig3.jpg"> Figura 3: Resistenza di c. elegans di p. aeruginosa dipende da vie immuni ospite. Un gruppo di selezionati RNAi atterramenti è stato trattato con p. aeruginosa (A) o 1,10-fenantrolina (un chelante chimico che imita l'esposizione a p. aeruginosa in liquido) (B). p < 0.01, #p < 0,05, basato su t di Student-test. Barre di errore rappresentano s.e.m. 10 pozzi sono stati utilizzati per replica biologico a condizione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58068/58068fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig4.jpg"> Figura 4: Uccisione di c. elegans da p. aeruginosa è robusto e dipende dalla concentrazione batterica. Immagini rappresentative (A-B) (A) e quantificazione (B) di c. elegans morte dopo l'esposizione a concentrazioni variabili di p. aeruginosa per 72 h. p-valori sono stati calcolati basati su Student t -test. Barra della scala in (A) è di 1 mm. 16 pozzi sono stati utilizzati per replica biologico a condizione. BF: Brillante campo, FL: fluorescenza. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58068/58068fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig5.jpg"> Figura 5: elaborazione dei dati di acquisizione e l'immagine di un test con un forte segnale. (A) immagini rappresentative dei live (controllo negativo) e morti (controllo positivo) di c. elegans. (B) analisi statistica dei controlli positivi e negativi, basato sul metodo di acquisizione dati, modalità di elaborazione e numero di pozzi analizzati. Fluorescenza (C) è stato analizzato per i vermi da quattro singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (due positive e due pozzetti di controllo negativo). Ogni bene contenuta ~ 100 vermi. Ogni punto sul grafico rappresenta un singolo verme, mostrando il tempo di volo (che correla con ma, a causa l'avvolgimento delle viti senza fine viventi, imperfettamente rappresenta dimensioni) e la fluorescenza misurata per i vermi che sono macchiati con Sytox Orange. Controllo positivo vermi pre-sono stati uccisi da esposizione al calore. A causa di cambiamenti nella tensione e nella forma di vermi morti (come si può vedere nel(), vermi morti appaiono più rod-like e hanno alcuni tornanti di corpo) rispetto alle loro controparti viventi, vermi morti hanno un TOF più a lungo. p-valori sono stati calcolati basato su t di Student-test. Barra della scala nel()è 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58068/58068fig5large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig6.jpg"> Figura 6: elaborazione dei dati immagine e acquisizione di un test con un segnale moderato. (A) immagini rappresentative di c. elegans che trasportano un reporter di rosa-1::GFP viscoelastico e un marcatore costitutiva mCherry (per normalizzare l'espressione dei geni dalla matrice extracromosomico). C. elegans esposto a DMSO (controllo negativo) o 1,10-fenantrolina (controllo positivo). (B) analisi statistica dei controlli positivi e negativi, basato sul metodo di acquisizione dati, modalità di elaborazione e numero di pozzi analizzati. (C) quattro singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (due positive e due pozzetti di controllo negativo) sono stati analizzati usando il flusso vermimetry. p-valori sono stati calcolati basato su t di Student-test. Barra della scala nel()è 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58068/58068fig6large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig7.jpg"> Figura 7: Uccisione di elegans del c. di E. faecalis è dipendente dal tempo e robusto. Immagini rappresentative (A-B) (A) e quantificazione (B) di c. elegans morte dopo l'esposizione di E. faecalis. p < 0.01, basato su t di Student-test. 10 pozzi sono stati utilizzati per replica biologico a condizione. Barre di errore rappresentano s.e.m. scala bar in (A) è 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58068/58068fig7large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

14.3K Views.  Rice University. Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Video: A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

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High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

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Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

High-throughput di Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

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Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Analisi del comportamento di grande c. elegans popolazioni utilizzando un ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma automatizzata

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...