Gli autori riconoscono il sostegno e il finanziamento del GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Ringraziamo la professoressa L. Patricia Hernandez del Dipartimento di Scienze Biologiche della George Washington University per aver ispirato l'indagine e la collaborazione in corso, fornendo competenze biologiche sulla fisiologia della carpa argentata e fornendo i campioni di muco. Ringraziamo gli studenti, David Palumbo, Carly Cohen, Isaac Finberg, Dominick Petrosino, Alexis Renderos, Priscilla Varghese, Carter Tegen e Raghav Pajjur per l'aiuto in laboratorio e Thomas Evans e James Thomas di TA Instruments, New Castle, DE per il supporto con la formazione e la manutenzione del reometro. Le immagini per le figure 5A, C sono state scattate durante una dissezione eseguita dalla professoressa L. Patricia Hernandez del Dipartimento di Scienze Biologiche della George Washington University.

1. Preparazione delle soluzioni di muco di varie concentrazioni
NOTA: Tre concentrazioni della soluzione di muco (400 mg/mL, 200 mg/mL e 100 mg/mL con volumi approssimativi, rispettivamente 1 mL, 1 mL e 2 mL) sono preparate per questo esperimento.
<ol><li>Per calcolare la massa del muco, misurare la massa media delle fiale con (Mcon-muco ; mg) e senza muco (Mfiale ; mg). Quindi sottrarre la massa delle fiale con muco con quella senza muco (Mmuco = Mcon-muco - Mfiale ; mg).</li>
	<li>Diluire il muco in tre concentrazioni (400, 200, 100, mg/mL) con acqua deionizzata (DI).<ol>
<li>Preparare la prima concentrazione della soluzione di muco, 400 mg/mL aggiungendo 0,6 mL di acqua DI al muco usando una micropipetta. NOTA: Poiché il volume approssimativo del muco estratto era di 1,4 ml, la soluzione da 400 mg/mL avrà un volume totale di ~ 2 ml.</li>
		<li>Posizionare il flaconcino di soluzione di muco da 400 mg/mL su uno shaker per assicurarsi che la soluzione di muco sia adeguatamente omogeneizzata e che qualsiasi agglomerato di particolato di muco sia mitigato.</li>
		<li>Preparare la seconda concentrazione della soluzione di muco, 200 mg/mL, prelevando metà del volume della soluzione di muco di prima concentrazione in un nuovo flaconcino utilizzando una micropipetta e aggiungendo 1 mL di acqua DI nel nuovo flaconcino.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.2.2 per il primo e il secondo flaconcino con soluzioni di muco.</li>
		<li>Preparare la terza concentrazione della soluzione di muco, 100 mg/mL, prelevando metà del volume (1 mL) della soluzione da 200 mg/mL in un nuovo flaconcino utilizzando una micropipetta e aggiungendo acqua DI nel nuovo flaconcino.</li>
		<li>Ripetere la fase 1.2.2 per tutte e tre le concentrazioni di soluzioni di muco nei rispettivi flaconcini (vedere Figura 1 supplementare).</li>
		<li>Conservare i flaconcini di soluzione di muco in frigorifero fino a quando non viene eseguita la calibrazione e il test del reometro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Misurazioni e acquisizione dati mediante reometro
NOTA: I software utilizzati in questo protocollo per il controllo dello strumento e l'acquisizione dati con reometro sono indicati nella Tabella dei materiali. Questo software sarà indicato come "software di controllo dello strumento del reometro".
<ol><li>Impostare e calibrare lo strumento reometro.<ol>
<li>Accendere l'alimentazione di aria compressa al reometro e assicurarsi che la tavola pneumatica e il reometro siano livellati utilizzando un misuratore di bolle. Togliere il cappuccio protettivo sull'albero del reometro e tenere fermo l'albero durante lo svitamento.</li>
		<li>Accendere gli interruttori principali del reometro per attivare i cuscinetti magnetici sul reometro.</li>
		<li>Accendere il computer di controllo del reometro con il software di controllo dello strumento del reometro installato al suo dentro e avviare il software di controllo dello strumento del reometro (vedere la Figura supplementare 2).</li>
		<li>Eseguire la calibrazione dello strumento selezionando le schede,'Calibrazione | Strumento' dalla finestra del software. Scegli l'opzione'Strumento'. Clicca su'Calibra'sotto'Inerzia'. Registrare il valore di calibrazione dell'inerzia dello strumento in μN.m.s2 e ripetere la calibrazione almeno 3 volte per assicurarsi che i valori di calibrazione siano entro il 10% l'uno dall'altro (vedere figura supplementare 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Installare la geometria del reometro sull'albero del reometro.<ol>
<li>Fare clic sulla scheda'Geometrie'nel software di controllo dello strumento del reometro.</li>
		<li>Pulire il cono con la geometria desiderata(diametro 40 mm, cono 1 ◦0' 11'') e la piastra di Peltier con isopropanolo (vedere Tabella 1, Tabella dei materiali, Figura 1e Figura 2). NOTA: La piastra Peltier viene installata sul reometro; può essere pulito con isopropanolo mentre è fissato direttamente al reometro.</li>
		<li>Assicurarsi che il dispositivo della piastra Peltier sia privo di polvere visibile e pulito, se necessario, con isopropanolo. Installare la piastra Peltier se non è preinstallata nel reometro e collegare le connessioni del dissipatore di calore.</li>
		<li>Premere il 'pulsante diblocco ' sul reometro sull'albero di blocco collegato alla geometria del cono. Questo arresta la posizione dell'albero, ma può ruotare liberamente nella posizione.</li>
		<li>Clicca su'Smart Swap | Abilitato' nella scheda del software di controllo dello strumento reometro per consentire il rilevamento automatico della geometria (vedi Figura supplementare 4).</li>
		<li>Ruotare l'albero sulla parte superiore del reometro per avvitare la geometria. Il software rileverà la geometria dell'angolo del cono di 40 mm di diametro, 1◦ 0' 11 '' in questa fase (vedere Tabella 1 e Tabella dei materiali).</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.2.5 – 2.2.6 per assicurarsi che la geometria venga rilevata.</li>
		<li>Seleziona'Gap'sotto il'Pannellodi controllo' del software di controllo dello strumento reometro, fai clic sull'icona'Opzioni'e scegli l'opzione'Forza assiale'. Impostare la forza assiale su '1 Newton'; questo per garantire che la geometria del cono tocchi la piastra di Peltier per l'inizializzazione dello spazio zero (vedere figura supplementare 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la calibrazione della geometria del reometro.<ol>
<li>Selezionare la scheda 'Geometria' dalla finestra del software. Clicca su'Calibra'sotto'Inerzia'. Registrare il valore di calibrazione dell'inerzia geometrica in μN.m.s2 e ripeterlo 2-3 volte per assicurarsi che i valori di calibrazione siano entro il 10% l'uno dall'altro.</li>
		<li>Fare clic su'Calibra'sotto'Attrito'nella finestra del software. Registrare il valore di calibrazione dell'attrito geometrico in μN.m/(rad/s) e ripeterlo 2-3 volte per assicurarsi che i valori di calibrazione siano entro il 10% l'uno dall'altro (vedere figura supplementare 6).</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'inizializzazione zero-gap NOTA: poiché la geometria non può essere sollevata con precisione sopra la piastra di Peltier per eseguire misurazioni senza una posizione "zero" di riferimento, viene eseguita l'inizializzazione zero-gap. Ai fini della misurazione, la geometria ha uno spazio geometrico incorporato di 24 μm e uno spazio di assetto di 28 μm. Lo spazio di assetto è impostato per pulire efficacemente il fluido in eccesso che potrebbe fuoriuscire al di fuori della superficie della geometria. Queste lacune sono indispensabili per misurare con precisione i dati utilizzando il campione e il reometro. Il passaggio 2.4.1 è assolutamente necessario per assicurarsi che la geometria sia impostata su zero gap per ottenere la geometria e gli spazi di taglio di 24 μm e 28 μm, rispettivamente.<ol>
<li>Fai clic sull'icona'Zero gap'sotto la scheda'Gap'nel'Pannello di controllo'nella finestra del software. L'inizializzazione è completa quando la forza assiale sperimentata dalla geometria è maggiore o uguale a 1 N, in quanto tocca la piastra di Peltier. Assicurarsi che lo spazio del reometro sia azzerato in modo che la sua posizione di riferimento sia accurata (vedere la figura supplementare 7 e la figura supplementare 8).</li>
		<li>Premere i controlli 'freccia su e giù' sullo strumento reometro o 'geometria alza e abbassa' icone sotto la scheda 'Gap' nel software di controllo dello strumento reometro per aumentare la geometria a qualsiasi altezza arbitraria. La schermata di controllo sullo strumento reometro e il pannello di controllo del software di controllo dello strumento reometro visualizzeranno la (stessa) altezza dello spazio.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare la procedura sperimentale nel software di controllo dello strumento reometro. Eseguire la caratterizzazione delle proprietà reologiche utilizzando una geometria a piastra di cono su Peltier a 22 °C. NOTA: Il sito web dell'US Geological Survey è stato utilizzato per accertare la temperatura dell'acqua del fiume Il 20 settembre 2018, quando la carpa argentata utilizzata per gli esperimenti di muco GR è stata pescata nella posizione di Hart Creek36. La temperatura del muco può influenzare le proprietà reologiche. Il significato di regolare i valori alla temperatura del fiume è quello di corrispondere approssimativamente alla temperatura sotto la quale le proprietà del muco possono essere realisticamente stimate.<ol>
<li>Seleziona la scheda'Esperimenti'nel software di controllo dello strumento reometro e inserisci le informazioni pertinenti come'Nome','Operatore','Progetto'ecc.  (cfr. figura 9 supplementare)</li>
		<li>Selezionare la scheda 'Geometria' e assicurarsi che le informazioni siano conformi ai passaggi 2.2.5. - 2.2.7. (cfr. figura 10 supplementare).</li>
		<li>Selezionare la scheda''Procedura',e utilizzare i tasti freccia impostare '1: Ampiezza di oscillazione' procedura. (cfr. figura 11 supplementare).</li>
		<li>Inizializzare le impostazioni di'Controllo ambientale'come segue: 'Temperatura = 22 °C'; 'Tempo di ammollo = 120 s' e selezionare la casella 'Attendi la temperatura' (vedi Figura supplementare 11).</li>
		<li>Inizializzare le impostazioni di 'Parametri di test' come segue: 'Frequenza = 1 Hz'; impostare 'Sweep logaritmico'; «Coppia = da 10 a 10000 μN.m»; «Punti per decennio = 5» (cfr. figura supplementare 11).</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare l'esperimento per determinare il lineare viscoelastico range (LVR) del muco di concentrazione nota (100 mg/mL)<ol>
<li>Utilizzando un'appropriata micropipetta e punta della pipetta si aspirano circa 0,3 mL di soluzione di muco di pesce di concentrazione 100 mg/mL (vedere Fase 1.2, Tabella dei materiali).</li>
		<li>Introdurre la soluzione di muco sulla piastra di Peltier usando la micropipetta (vedere Figura 2).</li>
		<li>Premere il pulsante'Trim Gap'sul reometro per abbassare la geometria sulla piastra peltier. In alternativa, fare clic sull'icona'Trim Gap'sotto la scheda'Gap'nell'opzione'Pannello di controllo'nel software di controllo dello strumento reometro (vedere Figura supplementare 12).</li>
		<li>Utilizzare la micropipetta con la punta della pipetta per rimuovere qualsiasi soluzione di muco in eccesso e assicurarsi che il fluido si trova sotto la geometria senza fuoriuscite vicino alla periferia della geometria. NOTA: il caricamento improprio del fluido porterà a errori nelle misurazioni. Il campione sotto riempito ridurrà la distribuzione della coppia e il campione sovrasempito porterà a distribuzioni di stress errate a causa della fuoriuscita lungo i bordi.</li>
		<li>Selezionare alternativamente le schede'Motor'e 'Velocity' a 5 rad/s e 0 rad/s, fino a quando non c'è inerzia e velocità minime nel campione sotto la geometria. La schermata di controllo sullo strumento reometro e il pannello di controllo del software di controllo dello strumento reometro visualizzeranno la velocità (vedere figura supplementare 13).</li>
		<li>Premere il pulsante'Geometry Gap'sul reometro per abbassare la geometria allo spazio adatto preimpostato per geometria specifica. In alternativa, fare clic sull'icona'Geometry Gap'sotto la scheda'Gap'nell'opzione'Pannello di controllo'nel software di controllo dello strumento reometro (vedere figura supplementare 14).</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'esperimento per determinare l'intervallo viscoelastico lineare (LVR) del muco della concentrazione nota (100 mg / mL).<ol>
<li>Fare clic sull'icona'Start'sul software di controllo dello strumento del reometro (vedere la Figura supplementare 15). NOTA: Il reometro esegue misurazioni automatiche; una volta premuto il pulsante'Start',il reometro impiegherà circa 20 minuti per completare il test. L'impostazione "Punti per decennio" nel passaggio 2.5.5 determina quanto tempo avrà bisogno il reometro per completare le misurazioni.</li>
		<li>Esegui l'esperimento facendo clic su "Sì" nella finestra pop-up che appare e suggerisce che lo spazio geometrico venga abbassato alla distanza corretta per iniziare l'esperimento, se non già abbassato.</li>
		<li>Osservare il grafico in tempo reale generato dal reometro che riporta i moduli di stoccaggio (G') e perdita (G''). NOTA: G' e G' sono rispettivamente i moduli di stoccaggio e perdita. Il modulo di stoccaggio rappresenta la tendenza del materiale a recuperare la sua forma originale a seguito di deformazioni indotte da sollecitazioni ed è equivalente all'elasticità. Il modulo di perdita rappresenta la misura in cui il materiale resiste alla tendenza al flusso ed è rappresentativo della viscosità del fluido (vedi Figura 4).</li>
		<li>Impostate l'asse X del plottaggio su 'Percentuale di deformazione dell'oscillazione'. Per fare ciò, fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico presentato e scegliere lascheda 'Variabili grafico' (vedere Figura supplementare 16).</li>
		<li>Registrare l'intervallo percentuale di deformazione dell'oscillazione dal grafico prima che il materiale entri nell'intervallo viscoelastico non lineare, una volta completato il test.</li>
		<li>Premere i controlli 'freccia su e giù' sullo strumento del reometro o le icone 'geometry raise and lower' sotto la scheda 'Gap' nel software di controllo dello strumento del reometro per elevare la geometria a qualsiasi altezza arbitraria sopra la piastra di Peltier.</li>
		<li>Salvare il file che contiene sia la procedura sperimentale che i risultati nel formato di file nativo del software di controllo dello strumento reometro per accertare la regione viscoelastica lineare (LVR) del campione di muco. NOTA: questo può essere fatto impostando l'asse X del grafico sull'ampiezza di deformazione (%) e/o sulla sollecitazione di <img alt="Equation omega" src="/files/ftp_upload/61379/61379eqomega.jpg" style="font-size: 14px;"> oscillazione prima che i dati entrino nella regione viscoelastica non lineare (NLVR) (vedere figura supplementare 16).</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire gli sweep dinamici e gli esperimenti di prova del flusso di taglio allo stato stazionario in Linear Viscoelastic Range (LVR) per il muco di concentrazione nota 100, mg / mL per generare risultati da tre campioni di muco indipendenti di 100 mg / mL. Eseguire questi passaggi sui campioni di concentrazione di muco disponibili singolarmente.<ol>
<li>Ripetere i passaggi 2.5.1 – 2.5.4.</li>
		<li>Inizializzare le impostazioni di 'Parametri di test' come segue: 'Frequenza = 1 Hz'; impostare 'Sweep logaritmico'; «Ceppo % = da 100 a 10000 %; 'Punti per decennio = 10'.</li>
		<li>Seleziona la scheda'Procedura'e usa i tasti freccia impostati sulla procedura '2: Frequenza di oscillazione'.</li>
		<li>Inizializzare le impostazioni di'Controllo ambientale'come segue: 'Temperatura = 22 °C'; 'Tempo di ammollo = 0,0 s'.</li>
		<li>Inizializzare le impostazioni di'Parametri di prova'come segue: 'Strain % = 1 %'; impostare 'Sweep logaritmico'; «Frequenza = da 20 a 1 Hz»; 'Punti per decennio = 10'.</li>
		<li>Selezionare la scheda'Procedura'e utilizzare i tasti freccia impostare la procedura '3: Flow Sweep'.</li>
		<li>Inizializzare le impostazioni di'Controllo ambientale'come segue: 'Temperatura = 22 °C'; 'Tempo di ammollo = 0,0 s'.</li>
		<li>Inizializzare le impostazioni di 'Parametri di prova' come segue: 'Velocità di taglio = da 1 a 10000 1/s'; «Punti per decennio = 10»; casella di controllo 'Rilevamento dello stato stazionario'.</li>
		<li>Ripeti i passaggi 2.7.1 – 2.7.2 e attendi fino al completamento dell'esperimento, circa 45 minuti.</li>
		<li>Premere i controlli 'freccia su e giù' sullo strumento reometro o le icone 'geometry raise and lower' nella scheda 'Gap' nel software di controllo dello strumento reometro per elevare la geometria a qualsiasi altezza arbitraria.</li>
		<li>Utilizzare salviette e guanti monouso per rimuovere e pulire il muco sulla piastra di Peltier con soluzione di isopropanolo (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Salvare il file che contiene sia la procedura sperimentale che i risultati nel formato di file nativo del software di controllo dello strumento del reometro.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ripetere il protocollo per altre concentrazioni di soluzioni di muco di 200 mg/mL e 400 mg/mL.
<ol><li>Eseguire i passaggi 2.5 – 2.8 includendo tutte le sotto-fasi ivi elencate per le restanti due concentrazioni di soluzioni di muco, 200 mg / mL e 400 mg / mL.</li>
</ol>4. Rappresentazione grafica e analisi dei dati
NOTA: il codice fornito nel file di codice supplementare esegue la media dei dati e genera errori di ripetibilità, sovrappone i dati di tutti gli esperimenti. Le funzioni di calcolo della deviazione standard non sono disponibili nel software di controllo dello strumento del reometro. Il codice è scritto in un linguaggio di programmazione per l'analisi dei dati, la post-elaborazione e la rappresentazione grafica (vedi Tabella dei materiali per i dettagli).
<ol><li>Esportare i dati generati dal passo 2.8 relativo alla concentrazione di muco 100 mg/mL GR e dal passo 3.1 relativo alle concentrazioni di muco 200 mg/mL e 400 mg/mL GR in formato foglio di calcolo facendo clic sulla scheda 'File | Esporta | Excel' nel software di controllo dello strumento reometro (vedi Figura supplementare 17).</li>
	<li>Eseguire codici supplementari per generare grafici di viscosità apparente (η) per velocità di deformazione di taglio variabili ( <img alt="Equation y" src="/files/ftp_upload/61379/61379eqy.jpg"> ) e modulo di perdita (G), modulo di stoccaggio (G') e angolo di fase (δ) per variare lo stress di oscillazione ( ) e <img alt="Equation omega" src="/files/ftp_upload/61379/61379eqomega.jpg"> generare risultati rappresentativi.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cohen, K. E., Hernandez, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+trophic+anatomy+of+silver+carp,+Hypophthalmichthys+molitrix,+highlighting+a+novel+type+of+epibranchial+organ.">The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ.</a> Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).</li><li>Cohen, K. E., Hernandez, L. 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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Uno degli obiettivi principali dello sviluppo di questo protocollo è quello di stabilire che è adatto per la caratterizzazione reologica del muco GR quando sono disponibili volumi di campione molto piccoli. Riconosciamo che sono necessari più campioni da una scuola di carpa argentata per caratterizzare pienamente le proprietà reologiche del muco GR e i dati qui presentati non sono una generalizzazione sull'intera popolazione di carpe argentee. La nostra tecnica è giustificata dalla sua efficacia con la caratterizzazione reologica di piccoli volumi di campioni e con indagini estese che coinvolgono insiemi più grandi di campioni di muco.
I passaggi critici all'interno del protocollo sono la preparazione di soluzioni di muco di varie concentrazioni, misurazioni e acquisizione dati utilizzando un reometro rotazionale e rappresentazione grafica e analisi dei dati per approfondimenti fisici.
Le informazioni fisiche sui dati del muco GR sono tratte dalle rappresentazioni grafiche mostrate nella Figura 3 e nella Figura 4, che sono annotate con gli attributi del comportamento materiale previsto. I valori di viscosità della velocità di deformazione a taglio zero (ηo) possono essere osservati a basse velocità di deformazione a taglio in cui domina la mobilità delle molecole di materiale (Figura 3A e Figura 8A). I valori di viscosità della deformazione a taglio infinito(η ∞) nei fluidi non newtoniani sono ordini di grandezza inferiori alla viscosità della velocità di deformazione a taglio zero. Questi dati possono essere notati ad alte velocità di taglio in cui c'è poca o nessuna dipendenza dalle interazioni intermolecolari (Figura 3A e Figura 8A). Per i fluidi non newtoniani, le viscosità apparenti diminuiscono progressivamente all'aumentare delle velocità di taglio e raggiungono un valore basso costante (Figura 3A e Figura 8A). Il comportamento di resa nel muco GR sotto misure allo stato stazionario può essere rappresentato con pendenza come mostrato in Figura 3A e presentato nell'equazione 1., dove ηa rappresenta la viscosità apparente, σ y è losforzo di snervamento (costante) e <img alt="Equation y" src="/files/ftp_upload/61379/61379eqy.jpg"> è la velocità di deformazione di taglio.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61379/61379eq1.jpg">
La Figura 3A e la Figura 8B sono presentate su una scala log-log e pertanto l'equazione 1 raggiunge la seguente forma:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61379/61379eq2.jpg">
dove k – rappresenta la sollecitazione di snervare apparente. Su una scala log-log, la viscosità apparente diminuisce con una pendenza di '-1' indica la resa del materiale come mostrato nella Figura 3A10.  Le concentrazioni di muco di 200 mg/mL e 400 mg/mL possedevano pendenze rispettivamente di -1,8 e -0,91 e dimostrano il comportamento cedevole (Figura 8A). Nelle misurazioni dell'oscillazione dinamica, le caratteristiche viscoelastiche sono indipendenti dall'ampiezza della deformazione nella regione viscoelastica lineare (LVR) (Figura 4). Il comportamento cedevole nel muco GR sotto misure di oscillazione dinamica può essere osservato quando il materiale viscoelastico (muco GR) entra nella regione viscoelastica non lineare (NLVR) quando il modulo di stoccaggio (G') diminuisce (Figura 4). Nel regime NLVR il materiale viscoelastico dimostrerà un comportamento solido-gel-like se il modulo di stoccaggio è maggiore del modulo di perdita (G' > G"). Quando il modulo di perdita supera il modulo di memorizzazione (G' < G), si verifica un "crossover" tra G' e G' di dati. Come mostrato nella Figura 7B,C,le concentrazioni di muco 200 mg/mL e 400 mg/mL GR hanno dimostrato un comportamento fluido-simile caratterizzato dal "crossover" tra I dati G' e G". La sollecitazione di snervazione apparente sotto misure allo stato stazionario è rappresentata come il valore medio della sollecitazione fino al raggiungimento di un punto di inflessione (Figura 3B). Successivamente, lo stress inizia ad aumentare bruscamente con un aumento della velocità di deformazione di taglio come mostrato nella Figura 3B e nella Figura 8B. I dati GR sul muco (concentrazioni di 200 mg/mL e 400 mg/mL) hanno mostrato un comportamento del fluido di assottigliamento al taglio fino a quando il materiale non inizia a cedere (Figura 8A,B). Lo stress di resa apparente è stato osservato chiaramente in concentrazioni di muco di 200 mg/mL e 400 mg/mL a causa delle loro caratteristiche non newtoniane (Figura 8B). Lo stress di rendimento apparente sotto misure di oscillazione dinamica è mostrato nella Figura 4 e nella Figura 7B,C come la regione "crossover" tra i dati G' e G', seguita dai valori G' superiori a G'. I dati di 400 mg / mL GR di muco hanno mostrato un comportamento non newtoniano che si assottiglia al taglio. Il punto di inizio della resa del materiale è stato osservato con uno stress di snervazione apparente di circa 0,2736 Pa (Figura 7C). La transizione da idrogel a fluido con variazioni dell'angolo di fase (δ = tan-1 (G"/G')) è presentata nelle Figure 4 e 7D-F. L'estremo nell'angolo di fase è associato a un solido di Hookean a 0° e a un fluido viscoso a 90° come mostrato in Figura 4. I valori dell'angolo di fase intorno a 45° sono stati attribuiti alla transizione del comportamento gelatinoso del materiale a un comportamento simile al fluido. La concentrazione di muco di 400 mg/mL ha mostrato chiaramente un cambiamento nella caratteristica del materiale da idrogel a comportamento simile al fluido attraverso il processo di resa con uno stress di snervamento apparente di ~ 0,2736 Pa (Figura 7F).
Comprendere i limiti della misurazione ed evitare dati inadatti all'interpretazione fisica è una sfida con fluidi biologici complessi e morbidi, specialmente negli studi che coinvolgono piccoli volumi di campioni11. I dati generati sotto effetti a bassa coppia e flusso secondario non sono adatti all'interpretazione fisica e dipendono dalla geometria utilizzata nel reometro (come cono e piastra in questo studio). Questi regimi sono stati identificati per evitare qualsiasi rappresentazione errata dei dati sperimentali che soffrono di risoluzione dello strumento e artefatti di misurazione a causa della diffusione del momento. I limiti di bassa coppia (Figura 6A e Figura 8A) sono funzioni di geometria e coppia minima generata dallo strumento (Tabella 1). In condizioni di misurazione a taglio costante, il criterio per respingere i dati influenzati dal limite di bassa coppia per una geometria a piastra conica di raggio (R) con coppia minima (Tmin = 10 x10 -9 Nm, Tabella 1) è stato discusso da Ewoldt et al. ed è presentato sotto11:
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61379/61379eq3.jpg">
dove <img alt="Equation y" src="/files/ftp_upload/61379/61379eqy.jpg"> è la velocità di deformazione di taglio.  A differenza delle concentrazioni di muco 100 mg/mL GR, le concentrazioni di muco 200 mg/ml e 400 mg/mL GR non sono state influenzate da effetti a bassa coppia che dimostrano chiaramente un comportamento non newtoniano, di assottigliamento al taglio con viscosità ad alta velocità di deformazione a taglio zero a basse velocità di deformazione di taglio. Il criterio per i moduli viscoelastici minimi misurabili sotto misure di oscillazione dinamica è stato discusso da Ewoldt et al. e presentato di seguito (Equazione 4)11. Nell'equazione 4, per una geometria a piastra conica di raggio (R) la coppia minima sotto taglio oscillatorio (Tmin = 2 x 10-9 Nm, Tabella 1).
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61379/61379eq4.jpg">
dove Gmin è il modulo di stoccaggio (G') o modulo di perdita (G") e è la velocità di deformazione di taglio. I regimi di limitazione della strumentazione disciplinati da effetti a bassa coppia sono contrassegnati nelle figure 6A e 6B. Il regime di flusso secondario sotto misure allo stato stazionario è governato da una diffusione del momento verso l'interno del fluido per mezzo di un vortice che risiede all'interno del cono rotazionale e della geometria della piastra11. Il modello di flusso secondario aumenta la coppia in modo errato facendo sembrare che il fluido stia ispessendo il taglio (Figura 8A). Il limite di flusso secondario, proposto da Ewoldt et al. nella Figura 8A è stato disegnato utilizzando la seguente relazione11:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61379/61379eq5.jpg">
dove L = βR, β è l'angolo del cono, R è il raggio del cono, ρ = 1000 kg m-3, Recrit = 4 e <img alt="Equation y" src="/files/ftp_upload/61379/61379eqy.jpg"> è la velocità di taglio. Questo regime ha aiutato a stimare i valori di viscosità del ceppo a taglio infinito (η∞) nei campioni di muco GR.
Una modifica del protocollo può essere effettuata utilizzando una geometria a piastra piatta anziché la geometria della piastra a cono come mostrato nel protocollo qui presentato. Le prove a piastra piatta devono essere eseguite con una variazione parametrica del gap di misura nel reometro rotazionale per rivelare la dipendenza dello stress di resa apparente dal gap di misura e dalla geometria. I miglioramenti suggeriti del protocollo presentati in questo documento sono descritti di seguito. Deve essere eseguita una variazione parametrica dell'ampiezza della deformazione nel regime viscoelastico lineare (LVR) e della frequenza di oscillazione. I test reologici "Tack and peel" devono essere eseguiti per sviluppare una piena comprensione dell'adesività del muco GR. Le caratteristiche reologiche del muco GR devono essere eseguite su insiemi di volume di campioni più grandi insieme a studi per misurare eventuali tracce di cellule del sangue per tenere conto del suo effetto sulle proprietà reologiche complessive di GR.
Le limitazioni del protocollo sono descritte di seguito. La complessità delle procedure di estrazione del muco GR e la presenza di cellule del sangue o frammenti di tessuto nei campioni di muco possono influenzare la reologia del muco. Tuttavia, va notato che il muco utilizzato nel protocollo non aveva tracce visibili di sangue. Il campione di muco GR è un materiale eterogeneo e può possedere diverse proprietà reologiche a causa della varianza nella posizione e nelle condizioni post-estrazione. Questa limitazione è stata affrontata omogeneizzando sufficientemente il muco GR utilizzando uno shaker per abbattere eventuali grandi ciuffi di muco e presenza tissutale. Un'altra importante limitazione sono i volumi molto piccoli del campione di muco GR (circa 1,4 ml), raccolti per analisi che limitano una generalizzazione delle proprietà del muco GR.
Il significato di questo protocollo è che consente un'accurata caratterizzazione reologica di fluidi biologici non newtoniani come il muco. Il protocollo qui presentato apre la strada allo studio di altri fluidi biologici simili associati a secrezioni umane, animali e vegetali. Inoltre, fluidi sintetici o soluzioni a base di polimeri che sono analoghi dei fluidi biologici possono essere sottoposti a test utilizzando questo protocollo per comprendere le proprietà del materiale sotto sollecitazioni variabili, frequenze di oscillazione e temperatura. Il protocollo è adatto per la caratterizzazione reologica di fluidi biologici quando vengono resi disponibili volumi di campioni moltopiccoli.
Il risultato esteso del protocollo è che l'apparente viscosità e l'apparente stress di snervamento del muco GR faciliteranno la creazione di modelli analitici per interpretare i risultati dell'indagine idrodinamica fondamentale sull'alimentazione del filtro e sulle tecnologie avanzate che richiedono e coinvolgono il flusso incrociato e la filtrazione a membrana.
Lo studio macroreologico postula che il muco a contatto con il particolato alimentare sia inizialmente, in uno stato gelatinoso che funge da adesivo. All'inizio delle forze di flusso e taglio il muco raggiunge un'apparente sollecitazione di snervamento e subisce una deformazione plastica. L'esecuzione del protocollo utilizzando un reometro rotazionale ha aiutato nella caratterizzazione della transizione del muco dal comportamento gelatinoso a quello fluido. Questa transizione è stata osservata sperimentalmente e lo stress di resa apparente è stato registrato a 0,2736 Pa in esperimenti di reometro rotazionale. Quando le sollecitazioni esterne sul muco sono inferiori all'apparente stress di resa, il muco dimostrerà un comportamento simile al gel per facilitare l'adesione del particolato alimentare. Quando le sollecitazioni esterne superano l'apparente stress di resa, il muco dimostrerà un comportamento di assottigliamento del taglio che faciliterà il trasporto di particelle alimentari agglomerate agli organi digestivi nella carpa argentata.

La carpa argentata, Hypophthalmichthys molitrix, è un alimentatore filtrante planctivoro e una specie invasiva che si è infiltrata in diversi corsi d'acqua naturali negli Stati Uniti. Questa specie è stata inizialmente introdotta nel bacino superiore del fiume Mississippi per controllare le fioriture algali1,2,3. La carpa argentata è un alimentatore estremamente efficiente. Tipicamente, le sue dimensioni delle particelle alimentari consumabili vanno da 4 a 20 μm a zooplancton più grandi che sono circa 80 μm3,4,5. Questa specie ha superato altri pesci nativi e può potenzialmente causare enormi danni ai corsi d'acqua nativi limitando le risorse disponibili1,2,6. Pertanto, l'alimentazione del filtro di pesci come la carpa argentata e la carpa bighead rappresentano una grave minaccia per i Grandi Laghi1,2,6,7,8.
I pesci che si nutrono di filtri possiedono organi speciali chiamati rastrellatori branchiali (GRI) con un sottile strato di muco che risiede sulla loro superficie. Questi organi migliorano l'efficienza della filtrazione e dell'aggregazione di piccole particelle dal fluido in entrata. L'obiettivo del protocollo qui presentato è quello di caratterizzare la proprietà non newtoniana del materiale di assottigliamento del taglio e lo stress di resa del muco GR acquisito dalla superficie interna dei rastrelli branchiali nella carpa argentata. Il valore dello stress di resa del GR-muco, accertato utilizzando un reometro rotazionale, è di interesse in questo studio. La tensione di snervamento misurata, chiamata anche "tensione di snervamento apparente", dipende dai metodi di prova come la velocità di taglio costante o la deformazione oscillatoria dinamica di tipo9,10. Il diradamento di taglio, "fluido di snervamento- stress", subisce una transizione dal comportamento solido a quello simile a quello liquido a una sollecitazione critica applicata9,11. Lo sforzo di snervamento apparente è lo sforzo di taglio minimo richiesto per avviare il flusso o quello in cui si osserva per la prima volta una deformazione plastica irreversibile quando il muco passa da un materiale gelatinoso a un materiale simile al fluido. Questo comportamento può essere osservato in materiali viscoelastici strutturati. La transizione dal comportamento gelatinoso a quello fluido del muco GR comporta due funzioni, ovvero un ruolo adesivo per raccogliere le particelle alimentari e un ruolo di veicolo di trasporto per assistere nel processo di consegna e filtrazione del particolato. La funzione estesa del muco include la creazione di barriere di diffusione nella resistenza alle malattie e nella respirazione, fornendo un rilascio controllato di fattori nutrizionali, componenti tossici ed escrezione, creando vie metaboliche per l'alimentazione e la nidificazione, aiutando nella protezione dei predatori e producendo modifiche dello strato limite che migliorano la locomozione e l'efficienza propulsiva12,13,14.
A differenza dei fluidi semplici, i fluidi complessi come il muco possiedono proprietà che variano con le condizioni di flusso e richiedono parametri di misurazione aggiuntivi per definire il loro comportamento fisico su scala di massa. Per monitorare la viscosità e lo stress di snervamento del muco GR, le misurazioni reologiche vengono eseguite utilizzando un reometro rotazionale. Il reometro rotazionale applica una sollecitazione o una deformazione di taglio costante o oscillatoria per mezzo di un disco rotante a contatto con il campione di fluido e ne misura la risposta. La logica alla base dell'utilizzo di questo strumento e tecnica è che il reometro può fornire una serie di misurazioni per descrivere le proprietà del materiale del muco GR della carpa argentata, che non può essere definito dalla sola viscosità.
Il muco è un materiale viscoelastico e la sua risposta meccanica ad una deformazione imposta è compresa tra quella di un solido puro (governato dalla legge di elasticità di Hooke) e quella di un liquido puro (governato dalla legge di viscosità di Newton)15,16. La complessa rete macromolecolare contenuta all'interno del muco può allungarsi e riorientarsi in risposta a forze esterne o deformazioni. Un reometro rotazionale è costituito da una geometria a cono e da una piastra di Peltier, come mostrato in Figura 1 e Figura 2 (vedere Tabella 1 per le specifiche della strumentazione). L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un protocollo per determinare le proprietà reologiche del muco GR. Un vantaggio del reometro rotazionale rispetto a un viscosimetro è la sua capacità di effettuare misurazioni dinamiche utilizzando piccoli volumi di campione. Il volume del campione di muco GR in questo studio era di circa 1,4 ml. Il viscosimetro, d'altra parte, è limitato a velocità di taglio costanti e richiede grandi volumi di campione.
Si prevede che le proprietà reologiche del muco varieranno notevolmente all'interno dell'anatomia della carpa argentata. Ad esempio, le proprietà del muco che risiede sulle superfici GR possono essere diverse dall'organo epibranchiale. Per tenere conto della potenziale variabilità delle proprietà del muco in diverse regioni del pesce, il campione di muco GR acquisito è stato diluito e sono state create e testate soluzioni di tre concentrazioni utilizzando il reometro rotazionale. I dati e i risultati relativi alla reologia del muco riportati dopo l'esecuzione del protocollo hanno dimostrato l'efficacia della tecnica di misurazione. I dati illustrativi presentati in questo documento non sono destinati ad essere generalizzati all'intera popolazione di carpe argentate. Il protocollo qui presentato può essere esteso per studiare la reologia del muco su set di campioni più grandi per testare altre ipotesi.
Lo scopo di questo studio è dimostrare la variazione delle proprietà reologiche della reologia del muco GR con tre diverse concentrazioni di muco (400 mg/mL, 200 mg/mL e 100 mg/mL). La concentrazione di 400 mg/mL rappresenta il campione di muco crudo raccolto dai PR del pesce. L'acqua deionizzata (DI) è stata utilizzata per diluire il campione di muco crudo in concentrazioni di 200 mg/mL e 100 mg/mL. La diluizione dei campioni di muco ha permesso la valutazione del grado di assottigliamento del taglio e dello stress di resa apparente in funzione della concentrazione e la determinazione della concentrazione alla quale il muco GR passa al comportamento non newtoniano. Uno shaker è stato utilizzato per abbattere eventuali grandi grumi di muco nei campioni per mitigare gli errori nei dati reologici dovuti alla disomogeneità.
Nella maggior parte dei vertebrati, compresi i pesci, le macromolecole predominanti che formano muco sono glicoproteine (mucine) che tendono a gonfiarsi in acqua per intrecci o reticolazione chimica e creano un materiale gelatinoso12,13,17,18,19,20. Le macromolecole ad alto peso molecolare, che formano gel e l'alto contenuto di acqua riflettono la scivolosità nelmuco 13. Un alto grado di interazioni inter-macromolecolari porta alla formazione di gel, mentre livelli più bassi di interazioni inter-macromolecolari o legami rotti provocano fluidi ad alta viscosità21.
I processi di filtrazione del particolato alimentare nell'alimentazione del filtro per pesci sono aiutati da proprietà legate al muco GR come la coesione e la viscosità che determinano il suo potenziale di adesione e tack22. La forza dell'adesione a base di muco dipende da specifiche interazioni intermolecolari, elettrostatiche o idrofobiche23. Sanderson et al.24 hanno condotto uno studio sull'alimentazione in sospensione nel pesce nero in cui hanno trovato le prove dell'adesione a base di muco. Hanno affermato che l'adesione di particolati alimentari sospesi con una superficie mucosale è seguita dal trasporto di grumi aggregati di particelle legate insieme al muco da un flusso d'acqua diretto che agisce su di esso24. Il muco esposto a velocità di taglio generate dal flusso d'acqua facilita la consegna di particolato alimentare agli organi digestivi. Le tecniche endoscopiche sono state utilizzate per osservare le particelle filtrate24.
La letteratura sulla gamma di velocità di taglio e limiti pratici nei test reologici del muco GR è scarsa. Pertanto, è stata richiesta una guida da studi reologici su muco gastrico, nasale, cervicale e polmonare, muco della pelle di salmone, melma di hagfish e lubrificante superficiale osseo-articolare in cui sono stati studiati la caratterizzazione reologica e gli attributi non newtoniani11,12,25, 26,27,28,29,30,31. Più recentemente, l'effetto del muco della pelle di pesce sulla locomozione e sull'efficienza propulsiva è stato studiato utilizzando la viscosimetria a velocità di taglio costante. Studi di reologia del muco cutaneo (senza alcuna diluizione o omogeneizzazione) relativi a orate, spigole e magre hanno dimostrato un comportamento non newtoniano a velocità di taglio tipicamente basse14.  In un altro studio correlato, i campioni di muco della pelle grezza dai lati dorsale e ventrale della sogliola senegalese sono risultati esibire un comportamento non newtoniano, indicando una maggiore viscosità del muco ventrale a tutte le velocità di taglio considerate32. Altri protocolli reologici relativi allo sviluppo dello scaffold idrogel e per sospensioni altamente concentrate mediante viscosimetro a velocità di taglio costante sono stati riportati anche in letteratura33,34.
In questo studio, le proprietà del muco GR sono state studiate utilizzando un reometro rotazionale controllato dalla velocità di deformazione che è stato ampiamente utilizzato in esperimenti di reologia su fluidi biologici complessi25. Per i fluidi newtoniani, la viscosità apparente rimane costante, è indipendente dalla velocità di taglio e le sollecitazioni di taglio variano linearmente con le velocità di deformazione di taglio (Figura 3A, B). Per i fluidi non newtoniani (come i fluidi di assottigliamento del taglio) la viscosità è dipendente dalla velocità di taglio o dalla storia della deformazione (Figura 3A, B). Il modulo di perdita (G") rappresenta la misura in cui il materiale resiste alla tendenza al flusso ed è rappresentativo della viscosità del fluido (Figura 4). Il modulo di stoccaggio (G') rappresenta la tendenza del materiale a recuperare la sua forma originale a seguito di deformazioni indotte da sollecitazioni ed è equivalente all'elasticità (Figura 4). L'angolo di fase (δ) o valore tangente di perdita, è calcolato dalla tangente inversa di G"/G'. Rappresenta l'equilibrio tra perdita di energia e stoccaggio ed è anche un parametro comune per caratterizzare i materiali viscoelastici (δ = 0° per un solido di Hookean; δ = 90° per un liquido viscoso; δ < 45° per un solido viscoelastico e δ > 45° per un liquido viscoelastico) (Figura 4)25. La tensione di snervamento apparente (σy) nei fluidi strutturati rappresenta un cambiamento di stato che può essere osservato nei dati reologici da sweep allo stato stazionario e sweep dinamici stress-deformazione10. Se la sollecitazione esterna applicata è inferiore alla sollecitazione di snervata apparente, il materiale si deformerà elasticamente. Quando la sollecitazione supera la sollecitazione di snervamento apparente (contrassegnata come "sollecitazione media" nella Figura 3B), il materiale passerà dalla deformazione elastica a quella plastica e inizierà a fluire allo stato liquido35. La misurazione del modulo di stoccaggio (G') e del modulo di perdita (G") nel campione di muco in condizioni di stress oscillatorio (o deformazione) quantifica il cambiamento dello stato materiale dal comportamento gelatinoso a quello viscoelastico simile al liquido.
I tipi di prove reometriche eseguite per monitorare i dati relativi al modulo di memorizzazione (G'), al modulo di perdita (G") e alla viscosità apparente (η) sono qui descritti. I test di oscillazione dinamica (sweep di deformazione e sweep di frequenza) hanno monitorato G' e G" sotto oscillazione controllata della geometria del cono. I test dinamici di deformazione hanno determinato la regione viscoelastica lineare (LVR) del muco monitorando la risposta intrinseca del materiale (Figura 4). Le sweep di deformazione sono state utilizzate per determinare il comportamento di resa a frequenza e temperatura di oscillazione costanti. I test di sweep a frequenza dinamica hanno monitorato la risposta del materiale all'aumento della frequenza (velocità di deformazione) a un'ampiezza costante (deformazione o sollecitazione) e temperatura. La deformazione è stata mantenuta nella regione viscoelastica lineare (LVR) per i test di sweep a frequenza dinamica. I test della velocità di taglio allo stato stazionario hanno monitorato la viscosità apparente (η) sotto rotazione costante della geometria del cono. Il muco GR è stato sottoposto a fasi di sollecitazione incrementali e la viscosità apparente (η, Pa.s) è stata monitorata per la variazione della velocità di taglio (ý, 1/s).
Il protocollo presentato in questo articolo tratta il muco GR come un materiale strutturato complesso di viscoelasticità sconosciuta con un certo intervallo di risposta viscoelastica lineare. Il muco del pesce è stato estratto dai GRI della carpa argentata durante una spedizione di pesca nella posizione del torrente Hart nel fiume Missouri dalla professoressa L. Patricia Hernandez (Dipartimento di Scienze Biologiche, The George Washington University) 1,2,36.  Una matrice di GRI all'interno della bocca di una carpa argentata è mostrata nella Figura 5A e un disegno schematico è presentato nella Figura 5B. Un GR asportato è mostrato nella Figura 5C.  L'estrazione del muco dai GRI della carpa argentata è presentata come esempio nei disegni schematici, Figura 5D,E. Tutte le prove del reometro sono state eseguite a temperatura costante e controllata di 22 ± 0,002 °C, la temperatura registrata nel sito di pesca1,2,36.  Ogni campione di muco è stato testato tre volte con il reometro e i risultati medi sono presentati insieme alle barre di errore statistiche.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td>To clean Sample from plate</td></tr><tr><td>Gloves</td><td>VWR</td><td>89428-750</td><td>To prevent contamination of sample</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td>To transport sample from vial to rheometer</td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>72830-042</td><td>To transport sample from vial to rheometer</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>VWR</td><td>89032-094</td><td>To homogenously mix sample of mucus</td></tr><tr><td>Vials</td><td>VWR</td><td>66008-710</td><td>Contains measured sample volumes</td></tr><tr><td>Weigh Scale</td><td>Ohaus</td><td>Scout &amp;ndash;SPX Balances</td><td>To weigh mass of mucus samples</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemical Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>De-Ionized Water (H20)</td><td>-</td><td>-</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>Sterile 70% Isopropanol (C3H8O)</td><td>VWR</td><td>89108-162</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;GR Mucus&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mg/mL concentration, 2mL</td><td>-</td><td>-</td><td>Viscoelastic Material</td></tr><tr><td>400 mg/mL concentration, 1mL</td><td>-</td><td>-</td><td>Viscoelastic Material</td></tr><tr><td>200 mg/mL concentration, 1mL</td><td>-</td><td>-</td><td>Viscoelastic Material</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2017a</td><td>Data analysis, post-processing and graphical representation</td></tr><tr><td>Trios</td><td>TA Instruments</td><td>v4.5.042498</td><td>Rheometer instrument control and analysis software</td></tr></tbody></table>

macro-rheology characterization of gill raker mucus in the silver carp, hypophthalmichthys molitrix

La carpa argentata, Hypophthalmichthys molitrix,è un pesce filtrante planctivoro invasivo che ha infestato i corsi d'acqua naturali del bacino superiore del fiume Mississippi grazie al suo meccanismo di alimentazione del filtro altamente efficiente. Gli organi caratteristici chiamati rastrellatori branchiali (GRI), che si trovano in molti di questi filtratori, facilitano la filtrazione efficiente di particelle di cibo come il fitoplancton che hanno dimensioni di pochi micron.
La motivazione per indagare la reologia del muco GR deriva dal nostro desiderio di capire il suo ruolo nell'aiutare il processo di alimentazione del filtro nella carpa argentata. Il fluido ricco di muco, in uno stato "denso e appiccicoso" può facilitare l'adesione del particolato alimentare. La permeazione e il trasporto attraverso la membrana GR sono facilitati dall'azione di forze di taglio esterne che inducono velocità di deformazione al taglio variabili. Pertanto, la reologia del muco può fornire un indizio vitale sulla tremenda natura di outcompeting della carpa argentata all'interno del pool di pesci che alimentano il filtro. Sulla base di ciò è stato ipotizzato che il muco GR possa fornire una funzione adesiva alle particelle alimentari e fungere da veicolo di trasporto per assistere nel processo di alimentazione del filtro.
L'obiettivo principale del protocollo è determinare lo stress di snervamento del muco, attribuito allo sforzo minimo di taglio richiesto per avviare il flusso al quale si osserva per la prima volta una deformazione plastica irreversibile attraverso un materiale viscoelastico strutturato. Di conseguenza, le proprietà reologiche del muco GR, cioè viscosità, stoccaggio e moduli di perdita, sono state studiate per la sua natura non newtoniana, di assottigliamento del taglio utilizzando un reometro rotazionale.
Un protocollo qui presentato è impiegato per analizzare le proprietà reologiche del muco estratto dai rastrellatori branchiali di una carpa argentata, pescato nella posizione di Hart Creek del fiume Missouri. Il protocollo mira a sviluppare una strategia efficace per i test reologici e la caratterizzazione materiale del muco assunto come materiale viscoelastico strutturato.

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Macro-Rheology Characterization of Gill Raker Mucus in the Silver Carp, Hypophthalmichthys molitrix

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire la caratterizzazione reologica del muco che risiede sui rastrellatori branchiali (GRI) della carpa argentata. Le caratteristiche viscoelastiche del GR-muco, ottenute misurando la viscosità, lo stoccaggio e i moduli di perdita, vengono valutate per l'apparente stress di snervamento per comprendere il meccanismo di alimentazione del filtro nelle GR.

Caratterizzazione macro-reologica del muco Gill Raker nella carpa argentata, Hypophthalmichthys molitrix

The silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, is an invasive planktivorous filter feeder fish that infested the natural waterways of the upper Mississippi ...

macro-rheology-characterization-gill-raker-mucus-silver-carp

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Engineering

Macro-Rheology Characterization of Gill Raker Mucus in the Silver Carp, Hypophthalmichthys molitrix

3.0K Views.  The George Washington University. Questo protocollo presenta un metodo per eseguire la caratterizzazione reologica del muco che risiede sui rastrellatori branchiali (GRI) della carpa argentata. Le caratteristiche viscoelastiche del GR-muco, ottenute misurando la viscosità, lo stoccaggio e i moduli di perdita, vengono valutate per l'apparente stress di snervamento per comprendere il meccanismo di alimentazione del filtro nelle GR.

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A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the gill where they transport ions such as Na+, Cl- and Ca2+ via a variety of ion channels, pumps and exchangers. The teleost gill is extrinsically innervated by the facial (VI), glossopharyngeal (IX) and vagus (X) nerves. The IX and X nerves are also the extrinsic source of branchial IC innervation. Here, two techniques used to study the innervation, proliferation and distribution of ICs are described: a time differential staining technique and a full bilateral gill denervation technique. Briefly, goldfish are exposed to a vital mitochondrion-specific dye (e.g., MitoTracker Red) which labels (red fluorescence) pre-existing ICs. Fish were either allowed to recover for 3 - 5 days or immediately underwent a full bilateral gill denervation. After 3 - 5 days of recovery, the gills are harvested and fixed for immunohistochemistry. The tissue is then stained with an &#945;-5 primary antibody (targets Na+/K+ ATPase containing cells) in conjunction with a secondary antibody that labels all (both new and pre-existing) ICs green. Using confocal imaging, it was demonstrated that pre-existing ICs appear yellow (labelled with both a viable mitochondrion-specific dye and &#945;-5) and new ICs appear green (labelled with &#945;-5 only). Both techniques used in tandem can be applied to study the innervation, proliferation and distribution of ICs on the gill filament when fish are exposed to environmental challenges.

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

Una tecnica Tempo colorazione differenziale Accoppiato con Full bilaterale Gill Denervation per studiare Ionocytes in Pesci

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, un metodo migliorato per Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Misura di particolato e sciolto composti elaborati da Alimentatori sospensioni attive

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Ambiente

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions &#8212; A Case Study for Screen-printing Silver Pastes

A comprehensive rheological characterization of highly concentrated suspensions or pastes is mandatory for a targeted product development meeting the manifold requirements during processing and application of such complex fluids. In this investigation, measuring protocols for a conclusive assessment of different process relevant rheological parameters have been evaluated. This includes the determination of yield stress, viscosity, wall slip velocity, structural recovery after large deformation and elongation at break as well as tensile force during filament stretching.
The importance of concomitant video recordings during parallel-plate rotational rheometry for a significant determination of rheological quantities is demonstrated. The deformation profile and flow field at the sample edge can be determined using appropriate markers. Thus, measurement parameter settings and plate roughness values can be identified for which yield stress and viscosity measurements are possible. Slip velocity can be measured directly and measuring conditions at which plug flow, shear banding or sample spillover occur can be identified clearly. 
Video recordings further confirm that the change in shear moduli observed during three stage oscillatory shear tests with small deformation amplitude in stage I and III but large oscillation amplitude in stage II can be directly attributed to structural break down and recovery. For the pastes investigated here, the degree of irreversible, shear-induced structural change increases with increasing deformation amplitude in stage II until a saturation is reached at deformations corresponding to the crossover of G' and G'', but the irreversible damage is independent of the duration of large amplitude shear. 
A capillary breakup elongational rheometer and a tensile tester have been used to characterize deformation and breakup behavior of highly filled pastes in uniaxial elongation. Significant differences were observed in all experiments described above for two commercial screen-printing silver pastes used for front side metallization of Si-solar cells.

A protocol for a robust and application relevant rheological characterization of highly concentrated suspensions is presented. Silver pastes used for screen-printing application in solar cell production are employed as model systems.

Le sfide in reologico Caratterizzazione di sospensioni altamente concentrato - un caso di studio per la serigrafia paste d&#39;argento

A comprehensive rheological characterization of highly concentrated suspensions or pastes is mandatory for a targeted product development meeting the ...

Ingegneria

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle shells provides unique design principles with potentials for guiding the design of protective materials and systems in the future. Understanding the structure-property relationships for these material systems at the microscale and nanoscale where failure initiates is essential. Currently, experimental techniques such as nanoindentation, X-ray CT, and SEM provide researchers with a way to correlate the mechanical behavior with hierarchical microstructures of these material systems1-6. However, a well-defined standard procedure for specimen preparation of mineralized biomaterials is not currently available. In this study, the methods for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of A. spatula using nanoindentation, FTIR, SEM, with energy-dispersive X-ray (EDX) microanalysis, and X-ray CT are presented.

Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

This paper presents the methods used for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of Atractosteus spatula (A. spatula) using nanoindentation, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM), and X-ray computed tomography (X-ray CT). The experimental results have been used to investigate the design principles of protective biological materials.

Caratterizzazione di Fish Scales Sovrapposizione (<em&gt; Atractosteus spatola</em&gt;) Usando Nanoindentazione, X-ray CT, FTIR e SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

Bioingegneria

Modeling the Size Spectrum for Macroinvertebrates and Fishes in Stream Ecosystems

The size spectrum is an inverse, allometric scaling relationship between average body mass (M) and the density (D) of individuals within an ecological community or food web. Importantly, the size spectrum assumes that individual size, rather than species&#8217; behavioral or life history characteristics, is the primary determinant of abundance within an ecosystem. Thus, unlike traditional allometric relationships that focus on species-level data (e.g., mean species&#8217; body size vs. population density), size spectra analyses are &#8216;ataxic&#8217; &#8211; individual specimens are identified only by their size, without consideration of taxonomic identity. Size spectra models are efficient representations of traditional, complex food webs and can be used in descriptive as well as predictive contexts (e.g., predicting responses of large consumers to changes in basal resources). Empirical studies from diverse aquatic ecosystems have also reported moderate to high levels of similarity in size spectra slopes, suggesting that common processes may regulate the abundances of small and large organisms in very different settings. This is a protocol to model the community-level size spectrum in wadable streams. The protocol consists of three main steps. First, collect quantitative benthic fish and invertebrate samples that can be used to estimate local densities. Second, standardize the fish and invertebrate data by converting all individuals to ataxic units (i.e., individuals identified by size, irrespective of taxonomic identity), and summing individuals within log2 size bins. Third, use linear regression to model the relationship between ataxic M and D estimates. Detailed instructions are provided herein to complete each of these steps, including custom software to facilitate D estimation and size spectra modeling.

This is a protocol to model the size spectrum (scaling relationship between individual mass and population density) for combined fish and invertebrate data from wadable streams and rivers. Methods include: field techniques to collect quantitative fish and invertebrate samples; lab methods to standardize the field data; and statistical data analysis.

Modellazione dello spettro delle dimensioni per macroinvertebrati e pesci negli ecosistemi di flusso

The size spectrum is an inverse, allometric scaling relationship between average body mass (M) and the density (D) of individuals within an ecological ...

Combining Microfluidics and Microrheology to Determine Rheological Properties of Soft Matter during Repeated Phase Transitions

The microstructure of soft matter directly impacts macroscopic rheological properties and can be changed by factors including colloidal rearrangement during previous phase changes and applied shear. To determine the extent of these changes, we have developed a microfluidic device that enables repeated phase transitions induced by exchange of the surrounding fluid and microrheological characterization while limiting shear on the sample. This technique is &#181;2rheology, the combination of microfluidics and microrheology. The microfluidic device is a two-layer design with symmetric inlet streams entering a sample chamber that traps the gel sample in place during fluid exchange. Suction can be applied far away from the sample chamber to pull fluids into the sample chamber. Material rheological properties are characterized using multiple particle tracking microrheology (MPT). In MPT, fluorescent probe particles are embedded into the material and the Brownian motion of the probes is recorded using video microscopy. The movement of the particles is tracked and the mean-squared displacement (MSD) is calculated. The MSD is related to macroscopic rheological properties, using the Generalized Stokes-Einstein Relation. The phase of the material is identified by comparison to the critical relaxation exponent, determined using time-cure superposition. Measurements of a fibrous colloidal gel illustrate the utility of the technique. This gel has a delicate structure that can be irreversibly changed when shear is applied. &#181;2rheology data shows that the material repeatedly equilibrates to the same rheological properties after each phase transition, indicating that phase transitions do not play a role in microstructural changes. To determine the role of shear, samples can be sheared prior to injection into our microfluidic device. &#181;2rheology is a widely applicable technique for the characterization of soft matter enabling the determination of rheological properties of delicate microstructures in a single sample during phase transitions in response to repeated changes in the surrounding environmental conditions.

We demonstrate the fabrication and use of a microfluidic device that enables multiple particle tracking microrheology measurements to study the rheological effects of repeated phase transitions on soft matter.

Combinazione di microfluidica e Microrheology per determinare le proprietà reologiche dei materiali molli durante le transizioni di fase ripetute

The microstructure of soft matter directly impacts macroscopic rheological properties and can be changed by factors including colloidal rearrangement ...

Automatic Image Processing to Determine the Community Size Structure of Riverine Macroinvertebrates

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community size structure responds to biotic and abiotic gradients, including anthropogenic perturbations across taxa and ecosystems. However, the manual measurement of small-bodied organisms such as benthic macroinvertebrates (e.g., &gt;500 &#181;m to a few centimeters long) is time-consuming. To expedite the estimation of community size structure, here, we developed a protocol to semi-automatically measure the individual body size of preserved river macroinvertebrates, which are one of the most commonly used bioindicators for assessing the ecological status of freshwater ecosystems. This protocol is adapted from an existing methodology developed to scan marine mesozooplankton with a scanning system designed for water samples. The protocol consists of three main steps: (1) scanning subsamples (fine and coarse sample size fractions) of river macroinvertebrates and processing the digitized images to individualize each detected object in each image; (2) creating, evaluating, and validating a learning set through artificial intelligence to semi-automatically separate the individual images of macroinvertebrates from detritus and artifacts in the scanned samples; and (3) depicting the size structure of the macroinvertebrate communities. In addition to the protocol, this work includes the calibration results and enumerates several challenges and recommendations to adapt the procedure to macroinvertebrate samples and to consider for further improvements. Overall, the results support the use of the presented scanning system for the automatic body size measurement of river macroinvertebrates and suggest that the depiction of their size spectrum is a valuable tool for the rapid bioassessment of freshwater ecosystems.

The article is based on the creation of an adapted protocol to scan, detect, sort, and identify digitized objects corresponding to benthic river macroinvertebrates using a semi-automatic imaging procedure. This procedure allows the acquisition of the individual size distributions and size metrics of a macroinvertebrate community in about 1 h.

Elaborazione automatica delle immagini per determinare la struttura delle dimensioni della comunità dei macroinvertebrati fluviali

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community ...

<meta charset="utf8"></head><body>Rimozione delle squame di pesce zebra per studi di coltura e biologia ossea

In Vitro Culturing Technique for Studying Cellular Dynamics in Zebrafish Scales

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without the need for euthanasia, regenerate within a couple of weeks, and are translucent and small, allowing them to be viewed using a standard microscope. Zebrafish scales are especially useful in educational environments, as they provide a unique opportunity for students to engage in hands-on learning experiences, particularly in understanding cellular dynamics and in vitro culturing methods. The main objective of this protocol is to describe a method for collecting and maintaining zebrafish scales in culture for use in a variety of biological studies using basic laboratory equipment. Additionally, the protocol details their use in understanding bone homeostasis by examining the activity of bone cells involved in bone resorption and deposition. It also includes additional protocols for general techniques, such as the visualization of nuclei and apoptotic cells. The in vitro culturing protocol produces reliable results with minimal reagents and equipment. This article discusses the benefits of using in vitro cultures of zebrafish scales to foster scientific inquiry and outlines the resources needed to support their integration into educational settings.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sull'attività delle cellule ossee con le squame di pesce zebra

This protocol offers a method to study cellular dynamics using a simple in vitro culture technique. It provides an opportunity for zebrafish researchers and educators to study cellular processes, such as those related to bone homeostasis and basic cell biology, by visualizing fluorescent nuclei and apoptotic cells within the scales.

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without ...

Caratterizzazione macro-reologica del muco Gill Raker nella carpa argentata, Hypophthalmichthys molitrix

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Una tecnica Tempo colorazione differenziale Accoppiato con Full bilaterale Gill Denervation per studiare Ionocytes in Pesci

VacuSIP, un metodo migliorato per Inex

Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Le sfide in reologico Caratterizzazione di sospensioni altamente concentrato - un caso di studio per la serigrafia paste d'argento

Caratterizzazione di Fish Scales Sovrapposizione (

Modellazione dello spettro delle dimensioni per macroinvertebrati e pesci negli ecosistemi di flusso

Combinazione di microfluidica e Microrheology per determinare le proprietà reologiche dei materiali molli durante le transizioni di fase ripetute

Elaborazione automatica delle immagini per determinare la struttura delle dimensioni della comunità dei macroinvertebrati fluviali

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish