Le cellule staminali embrionali umane possono essere indotte a differenziarsi in cellule progenitrici neurali e successivamente in astrociti neuronali e oligodendrociti. Tuttavia, il metodo di coltura del tipo per le cellule staminali embrionali umane e la loro differenziazione in cellule progenitrici neurali sono un sistema di co-coltura in vivo molto inefficiente e aperto Qui presentiamo un sistema di coltura migliorato e robusto che è facilmente scalabile utilizzando coltura di tipo a singola cellula ad alta densità con cellule staminali embrionali umane. La coltura di tipo a singola cellula delle cellule staminali embrionali umane fornisce un sistema rapido ed efficiente per studiare i meccanismi molecolari che regolano la differenziazione in più fasi lungo vari e distinti lignaggi differenziati, comprese le cellule progenitrici neurali e la loro successiva differenziazione in ulteriori lignaggi neurali.
Inizia preparando piastre rivestite a matrice di membrana basale qualificate per cellule staminali embrionali umane. Scongelare lentamente la soluzione a matrice di membrana basale a quattro gradi Celsius per almeno due o tre ore o durante la notte. Una volta scongelata, diluire la matrice in DMEM/F-12 freddo e mescolare bene dal 12% al 2% e rivestire ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con un millilitro della soluzione diluita.
Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per almeno tre ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Per passare le colture libere da alimentatori di cellule staminali embrionali umane di tipo colonia H9 coltivate su matrice di membrana basale, aspirare il mezzo dai pozzi e lavare una volta con un millilitro di DPBS. Aggiungere un millilitro di soluzione di dispasi ad ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Rimuovere la dispasi e lavare delicatamente le cellule una volta con due millilitri di DMEM/F-12. Dopo il lavaggio, rimuovere il mezzo e aggiungere due millilitri di DMEM / F-12 ad ogni pozzo. Staccare delicatamente le colonie tubazioni su e giù e trasferirle in un tubo da 15 millilitri.
Centrifugare il tubo a 370 volte g per due minuti. Aspirare il mezzo. Quindi dissociare i pellet cellulari in singole cellule aggiungendo due millilitri di soluzione di distacco cellulare e incubandoli a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Ripetere la centrifugazione e rimuovere la soluzione di distacco. Riprendono le cellule nel mezzo ESC umano mTeSR-1 con tubi delicatamente su e giù. Per adattare le cellule staminali embrionali umane di tipo colonia a una singola coltura di tipo cellulare, placcare da 1,5 a due milioni di cellule in ogni pozzo della piastra rivestita della matrice della membrana basale in due millilitri di mTeSR-1 contenenti 10 inibitori rock micromolari.
Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con mTeSR-1 fresco senza inibitore ROCK. Consentire alle celle di crescere come un singolo tipo di cella per tre giorni cambiando il mezzo ogni giorno. Il quarto giorno, dissociare le cellule in soluzione di distacco e ri-placcarle come descritto in precedenza.
Dopo aver risosospenso e incubato le cellule secondo le indicazioni del manoscritto, trasferire i piccoli corpi embrionali in un tubo da 15 millilitri, lasciarli depositare sul fondo e rimuovere delicatamente il mezzo con una pipetta. Trasferirli in mezzo EB e consentire loro di espandersi in piatti di attacco basso per sette giorni. Per indurre la cellula progenitrice neurale o la differenziazione NPC, dissociare le cellule staminali embrionali umane di tipo a singola cellula con un millilitro di soluzione di distacco e incubarle a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Centrifugare le cellule per due minuti a 370 volte g. Rimuovere il supernatante della soluzione di distacco. Quindi rimosi le celle in DMEM/F-12.
Placcare le cellule su una matrice di membrana basale rivestita con piastra a sei porri ad una densità di due volte 10 alla quinta cella per pozzo in due millilitri di mTeSR-1 con 10 inibitori rock micromolari. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di coltura con un mezzo di induzione neurale integrato con una dorsomorfina micromolare e cinque micromolari SB431542. Cambiare il mezzo a giorni diversi durante i primi quattro giorni di induzione neurale, quindi ogni giorno fino a raggiungere la confluenza al settimo giorno.
Dopo sette giorni di induzione neurale, dissociare le cellule aggiungendo un millilitro di soluzione di distacco e incubandole per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Centrifugare le cellule a 370 volte g e rimuovere la soluzione di distacco supernatante. Aggiungere un millilitro di mezzo di espansione NPC e pipettare delicatamente le celle su e giù per rimorsi.
Quindi placcare una volta 10 alla quinta celle per pozzo in due millilitri di mezzo di espansione NPC sulla matrice di membrana basale rivestita con piastre a sei pozzi. Passare le cellule se necessario quando le colture raggiungono il 90% di confluenza aggiungendo 10 inibitori rock micromolari durante i primi tre o quattro passaggi. Cambia il mezzo a giorni diversi durante l'espansione.
Per preparare piastre rivestite in laminina PLO, diluire la soluzione di stock PLO in PBS o acqua a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro, mescolare bene, quindi rivestire ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con un millilitro della soluzione. Incubare le piastre per almeno due ore a 37 gradi Celsius o durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavare ogni bene con PBS e subito dopo rivestire ogni bene con un millilitro di soluzione laminina preparato secondo le indicazioni del manoscritto.
Mantenere i piatti a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per differenziare i PNG in neuroni dopaminergici, placcare le cellule in piatti rivestiti di olp rivestiti di laminina in mezzo di espansione NPC ad una densità di circa il 50%Dopo 24 ore, cambiare il mezzo in DA1 e cambiare il mezzo a giorni alterni dopo. Per passare le colture quando raggiungono la confluenza, dissociare le cellule con un millilitro di soluzione di distacco e incubarle per 10 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi centrifugarli a 370 volte g e rimuovere la soluzione di distacco supernatante. Rimostrare le cellule in un millilitro di da1 medio e piatto una volta 10 alla quinta cellule in due millilitri di mezzo sulle piastre a sei pozzi rivestite di laminina PLO. Per differenziare gli NPC in astrociti, placcare le cellule sulle piastre laminine PLO e il mezzo di espansione NPC ad una densità del 50% cambiare il mezzo per astrocita dopo 24 ore e passare le cellule come descritto in precedenza.
Quando le cellule staminali embrionali umane di tipo colonia sono state adattate alla coltura del tipo a singola cellula, si è scoperto che le cellule erano in grado di essere mantenute ad alta densità, quindi sottocultura facile ed efficiente quando è stata raggiunta la confluenza. Queste cellule hanno mantenuto le caratteristiche del ciclo cellulare tipiche delle cellule staminali embrionali umane di tipo colonia come una breve fase G1 e un'alta percentuale di cellule in fase S. L'analisi quantitativa della PCR ha inoltre confermato che essi esprimono marcatori ESC a livelli paragonabili a quelli delle cellule di tipo colonia.
Inoltre, è stato dimostrato che le cellule staminali embrionali umane a singola cellula erano in grado di formare corpi embrionali contenenti cellule provenienti da tutti e tre gli strati germinali: endoderma, mesoderma ed ectoderma. È stato quindi dimostrato che le cellule staminali embrionali umane di tipo a singola cellula si sono differenziate efficacemente in NPC come indicato dalla perdita della morfologia tipica delle cellule staminali embrionali umane e dall'aspetto della morfologia NPC. La differenziazione è stata supportata dall'aumento dell'espressione dei marcatori NPC distintivi e confermata dall'immunosottenzione e dall'analisi FACS.
La stessa analisi ha anche mostrato che più del 90% delle cellule macchiate di positivo per le proteine SOX1, PAX6 e NCAM. Inoltre, i NPC derivati sono stati in grado di differenziarsi in neuroni dopaminergici e astrociti come indicato dalla comparsa di morfologie caratteristiche e dall'espressione di marcatori specifici del lignaggio. Quando si tenta questa procedura, è essenziale placcare le cellule staminali embrionali umane ad alta densità al fine di mantenere una coltura di cellule staminali embrionali umane sana e indifferenziata.
Questo protocollo fornisce una piattaforma per la produzione semplice, robusta e scalabile di progenitore e cellule differenziate che sarà scalabile per lo studio di base, lo schermo del farmaco e l'applicazione nella medicina neurodegenerativa.
