يمكن أن يتم حث الخلايا الجذعية الجنينية البشرية على التفريق في الخلايا السلف العصبية وبعد ذلك إلى الخلايا العصبية الفلكية و oligodendrocyte. ومع ذلك ، فإن طريقة ثقافة النوع للخلايا الجذعية الجنينية البشرية وتمايزها إلى خلايا السلف العصبي غير فعالة للغاية ومفتوحة في نظام الثقافة المشتركة في الجسم الحي هنا نقدم نظامًا ثقافيًا محسنًا وقويًا قابلًا للتطوير بسهولة باستخدام ثقافة نوع الخلايا الفردية عالية الكثافة مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. توفر ثقافة نوع الخلية المفردة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية نظامًا سريعًا وفعالًا لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم التمايز متعدد الخطوات على طول الأنساب المختلفة والمتميزة ، بما في ذلك الخلايا السلف العصبية وتمايزها اللاحق إلى أنساب عصبية إضافية.
تبدأ من خلال إعداد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المؤهلة مصفوفة الصفائح المغلفة. ذوبان ببطء في الطابق السفلي غشاء مصفوفة حل في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها. عندما ذاب، وتمييع المصفوفة في بارد DMEM/F-12 إلى 2٪ مزيج جيدا، ومعطف كل بئر من لوحة ستة جيدا مع ملليلتر واحد من محلول مخفف.
احتضان الصفائح المغلفة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل أو في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لتمرير الثقافات المغذية الخالية من نوع مستعمرة H9 الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تزرع على مصفوفة غشاء الطابق السفلي، وتفطن المتوسطة من الآبار وتغسل مرة واحدة مع ملليلتر واحد من DPBS. إضافة ملليلتر واحد من حل Dispase لكل بئر واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
إزالة Dispase وغسل بلطف الخلايا مرة واحدة مع ملليلتر اثنين من DMEM / F-12. بعد غسل, إزالة المتوسطة وإضافة ملليلتر اثنين من DMEM/F-12 إلى كل بئر. فصل بلطف المستعمرات عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 370 مرات ز لمدة دقيقتين. استلهم الوسط. ثم افصل كريات الخلية في خلايا مفردة عن طريق إضافة ميليلترين من حل مفرزة الخلية واحتضانها عند درجة مئوية 37 لمدة 10 دقائق.
كرر الطرد المركزي وإزالة حل مفرزة. Resuspend الخلايا في mTeSR-1 الإنسان ESC المتوسطة عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. لتكييف نوع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مستعمرة لثقافة نوع خلية واحدة، لوحة ما يقرب من 1.5 إلى 2 مليون خلية في كل بئر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لوحة المغلفة في مليلتر اثنين من mTeSR-1 التي تحتوي على 10 مثبطات الصخور الدقيقة.
بعد 24 ساعة، استبدل الوسط بمع طازج mTeSR-1 بدون مثبط روك. السماح للخلايا أن تنمو كنوع خلية واحدة لمدة ثلاثة أيام تغيير المتوسطة يوميا. في اليوم الرابع، افصل الخلايا في حل مفرزة وإعادة لوحة لهم كما هو موضح سابقا.
بعد إعادة الاعتماد على الخلايا واحتضانها وفقًا لاتجاهات المخطوطة، قم بنقل الأجسام الجنينية الصغيرة إلى أنبوب 15 ملليلتر، واتركها تستقر إلى الأسفل، وإزالة الوسط بلطف مع ماصة. نقلها إلى المتوسط EB والسماح لهم لتوسيع في أطباق مرفق منخفضة لمدة سبعة أيام. للحث على الخلية السلف العصبية أو التمايز المجلس الوطني للصحافة، فصل الخلايا الفردية نوع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ملليلتر واحد من حل مفرزة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة دقيقتين في 370 مرات ز. إزالة مفرزة حل فائقة. ثم إعادة تعليق الخلايا في DMEM/F-12.
لوحة الخلايا على مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة ستة لوحة جيدا في كثافة مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة في البئر في مليلتر اثنين من mTeSR-1 مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة. بعد 24 ساعة، استبدل الوسيطة الثقافية بوسيط تحريضي عصبي مكمّل بأخرى من دورسومورفين الصغيرة وخمسة ميكرومولار SB431542. تغيير المتوسط كل يومين خلال الأيام الأربعة الأولى من الحث العصبي، ثم كل يوم حتى يتم التوصل إلى التقاء في اليوم السابع.
بعد سبعة أيام من الحث العصبي، افصل الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من حل مفرزة واحتضانها لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. الطرد المركزي الخلايا في 370 مرات ز وإزالة مفرزة حل متراكب. إضافة ملليلتر واحد من توسيع المجلس الوطني للصحافة المتوسطة والماصات بلطف الخلايا صعودا وهبوطا إلى resuspend.
ثم لوحة واحدة مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في بئر في مليلترين من توسيع المجلس الوطني للصحافة المتوسطة على مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة ستة آبار. مرور الخلايا عند الضرورة عندما تصل الثقافات 90٪ التقاء إضافة 10 مثبطات الصخور الدقيقة خلال أول ثلاثة إلى أربعة مقاطع. تغيير الوسط كل يومين أثناء التوسع.
لإعداد لوحات مغلفة من قبل منظمة التحرير الفلسطينية، تمييع محلول مخزون منظمة التحرير الفلسطينية في برنامج تلفزيوني أو الماء إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل ملليلتر، ثم اخلط جيداً، ثم غطي كل بئر من صفيحة سداسية الآبار مع ملليلتر واحد من المحلل. احتضان لوحات لمدة ساعتين على الأقل في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد ذلك، يغسل كل جيدا مع برنامج تلفزيوني وعلى الفور بعد معطف كل بئر مع ملليلتر واحد من محلول اللامينيين التي أعدت وفقا لتوجيهات المخطوطة.
حافظ على الأطباق عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. لتمييز NPCs في الخلايا العصبية الدوبامين، لوحة الخلايا في الأطباق المغلفة في منظمة التحرير الفلسطينية في توسيع المجلس الوطني للصحافة المتوسطة في كثافة حوالي 50٪ بعد 24 ساعة، وتغيير المتوسطة إلى DA1 وتغيير المتوسطة كل يومين بعد ذلك. لتمرير الثقافات عندما تصل إلى التقاء، فصل الخلايا مع ملليلتر واحد من حل مفرزة واحتضانها لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية.
ثم الطرد المركزي لهم في 370 مرات ز وإزالة مفرزة حل متراكب. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من DA1 المتوسطة وطبقة مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا الخامسة في مليلترين من المتوسط على لوحات منظمة التحرير الفلسطينية المغلفة الستة آبار. لتمييز NPCs إلى الخلايا الفلكية، لوحة الخلايا على لوحات laminin منظمة التحرير الفلسطينية وPP توسيع المتوسطة في كثافة 50٪ تغيير المتوسطة إلى الأستروcyte المتوسطة بعد 24 ساعة، والمرور الخلايا كما وصف سابقا.
عندما تم تكييف نوع مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لثقافة نوع الخلية واحدة، وجد أن الخلايا كانت قادرة على الحفاظ على كثافة عالية، ثم بسهولة وكفاءة subcultureed عندما تم الوصول إلى التقاء. احتفظت هذه الخلايا بخصائص دورة الخلية النموذجية من نوع مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مثل مرحلة G1 قصيرة ونسبة عالية من الخلايا في المرحلة S. كما أكد التحليل الكمي PCR أنها تعبر عن علامات ESC عند مستويات مماثلة لتلك التي من خلايا نوع المستعمرة.
وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن الخلايا الوحيدة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية كانت قادرة على تشكيل أجسام جنينية تحتوي على خلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث: إندودم، ميسوديرم، وميكوديرم. ثم ثبت أن الخلايا الواحدة من نوع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية تختلف بكفاءة إلى NPCs كما هو مبين من خلال فقدان الشكل النموذجي للخلايا الجذعية الجنينية البشرية وظهور مورفولوجيا المجلس الوطني للصحافة. وقد دعم التمايز زيادة التعبير عن علامات NPC المميزة وتم تأكيده بواسطة تحليل الكبت بالمناعة وFACS.
كما أظهر التحليل نفسه أن أكثر من 90٪ من الخلايا تلطخت إيجابية لبروتينات SOX1 و PAX6 و NCAM. وعلاوة على ذلك، كانت قادرة على التمييز بين NPCs المشتقة في الخلايا العصبية الدوبامين والخلايا الفلكية كما هو مبين من قبل ظهور المورفورولوجيا المميزة والتعبير عن علامات النسب محددة. عند محاولة هذا الإجراء، من الضروري أن لوحة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في كثافة عالية من أجل الحفاظ على صحة, غير متمايزة الإنسان زرع الخلايا الجذعية الجنينية.
يوفر هذا البروتوكول منصة لإنتاج بسيط وقوي وقابل للتطوير من الخلايا السلف والمتمايزة التي ستكون قابلة للتطوير للدراسة الأساسية ، وشاشة الدواء ، والتطبيق في الطب العصبي.
