Le cellule HC11 ed EpH4 sono linee cellulari epiteliali del seno del topo che possono differenziarsi in coltura. Allo stesso tempo, queste cellule possono essere trasformate da un certo numero di oncogeni. Queste cellule sono ideali per lo studio dell'interrelazione tra differenziazione e trasformazione neoplastica.
Queste tecniche possono essere utilizzate negli studi di trasduzione del segnale per scoprire obiettivi per la terapia del cancro. Ad esempio, la piccola GTPasi Rac e altre molecole possono innescare la trasformazione delle cellule epiteliali del seno quando espresse a livelli elevati, ma sorprendentemente a bassi livelli, possono indurre differenziazione. Altri trasduttori di segnale possono comportarsi in modo simile.
I principi possono applicarsi anche ad altri tipi di differenziazione in cui la confluenza cellulare gioca un ruolo importante, ad esempio la differenziazione di adipociti o miotubi. Qualcuno che esegue questa tecnica per la prima volta dovrebbe tenere a mente che la placcatura delle cellule HC11 è importante. Questo perché il contatto da cellula a cellula è importante per la differenziazione.
Un altro punto da notare è che una corretta estrazione delle cellule EpH4 dalla matrice è fondamentale per la quantificazione delle proteine perché qualsiasi residuo influenzerà la determinazione delle proteine. La dimostrazione visiva di questo metodo è utile perché alcuni dettagli del protocollo sono difficili da descrivere su carta. Inizia preparando una bottiglia di 50 millilitri di mezzo cellulare HC11 secondo le indicazioni del manoscritto.
Per placcare le cellule, aspirare il mezzo da cinque piastre di Petri confluenti al 50% di centimetri e lavare le celle con circa 1,8 millilitri di tripside utilizzando una pipetta Pasteur sterile a nove pollici collegata in cotone. Quindi aggiungere 200 microlitri di tripina per piastra e ruotare la piastra per spostare le celle attaccate. Osservare le cellule in microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 4X per assicurarsi che abbiano iniziato a spodestarsi.
Quindi aspirare circa 1,5 millilitri di mezzo HC11 con una pipetta Pasteur sterile da nove pollici e spruzzarla verticalmente contro le cellule mentre ruota il piatto assicurandosi di evitare schizzi. Trasferire tutte le celle in bottiglia con mezzo HC11 e ruotare per disperdersi uniformemente nella bottiglia. Quindi aliquote la sospensione cellulare in 20 piastre di Petri di tre centimetri pipettando due millilitri di cellule per piatto.
Dondolare le piastre di Petri per diffondere le cellule e incubarle a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno successivo, quando le cellule sono confluenti dal 90 al 100%, aspirano il mezzo e lo sostituiscono con mezzo con FBS ma senza EGF. Dopo aver fatto crescere le cellule in mezzo senza EGF per 24 ore, aggiungere il mezzo di differenziazione a 10 piatti e far crescere le cellule per un massimo di 10 giorni mantenendo gli altri 10 piatti come controlli.
Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni con cellule trattate e di controllo HIP. Per monitorare la differenziazione, osservare le cellule con microscopia a contrasto di fase. Utilizzare la microscopia a fluorescenza se le cellule esprimono proteine fluorescenti verdi.
Inoltre, quantificare il grado di differenziazione estraendo proteine dalle cellule trattate e di controllo HIP una volta al giorno ed eseguendo l'analisi western Blot. Raccogliere e posizionare il mezzo di crescita EpH4, la matrice EHS e due tubi conici da 50 millilitri sul ghiaccio. Prechill le piastre di coltura tissutale con punte di pipetta a meno 20 gradi Celsius e preparare il mezzo di crescita EpH4 integrato con matrice del 10 o 20% in due tubi conici da 50 millilitri e tenerli sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per l'uso.
Dopo aver recuperato le piastre di coltura tissutale prechilled a meno 20 gradi Celsius, rivestire 10 pozzi della piastra a 24 porri con 150 microlitri di matrice non diluita diffondendo la matrice con una pipetta. Evitare di creare bolle quando si diffonde la matrice. Quindi toccare delicatamente i lati della piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire alla matrice di solidificarsi.
Nel frattempo, preparati per la differenziazione tripinando le cellule EpH4 così come precedentemente descritte e garantendo sospensioni a singola cellula dopo la resopensione delle cellule tripsinti. Quindi, conta le cellule in sospensione con un emocitometro. Trasferire cinque volte 10 alle quattro cellule per pozzo in un tubo di centrifuga conico sterile da 1,5 millilitri e girarle a 250 volte g per cinque minuti.
Aspirare con cura il mezzo supernatante e posizionare il tubo sul ghiaccio. Utilizzare una punta di pipetta da un millilitro per rimescolare le celle in 350 microlitri di mezzo di crescita EpH4 integrati con una matrice del 20% mantenendo i tubi sul ghiaccio assicurandosi di evitare bolle. Una volta che lo strato inferiore si è solidificato, aggiungere i 350 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzo rivestito e posizionarlo in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire allo strato a matrice del 20% di solidificarsi.
Osservare le celle con microscopia a contrasto di fase per assicurarsi che le singole celle siano visibili. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo EpH4 con matrice del 10% in cima e incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Inizia l'induzione della differenziazione un giorno dopo aver placcato le cellule nella matrice.
Rimuovere con cura 150 microlitri del mezzo matrice superiore al 10% e aggiungere 200 microlitri di supporto EpH4 contenente HIP e matrice al 10% e per i controlli aggiungere un mezzo matrice al 10% senza HIP. Sostituire il mezzo ogni due giorni per un massimo di 10 giorni monitorando la formazione della mammosfera con microscopia a contrasto di fase. Per quantificare la differenziazione, pipettare con cura il mezzo HIP a matrice del 10% dai pozzi e risciacquare lo strato a matrice del 20% con 350 microlitri di PBS ghiacciato.
Quindi aggiungere da 70 a 100 microlitri di PBS ghiacciato con un EDTA millimolare direttamente nei pozzi e staccare delicatamente lo strato inferiore della matrice al 100% con una punta di pipetta. Agitare delicatamente il piatto a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Trasferire con cura la sospensione dello sferoide su un tubo conico e sciacquare i pozzi con 500 microlitri di PBS EDTA per recuperare eventuali sferoidi rimanenti.
Dondolare il tubo sul ghiaccio per altri 30 minuti assicurandosi che la matrice si dissolva completamente. Se si vedono grumi a matrice visibile, aggiungere più PBS EDTA o agitare più a lungo. Centrifugare la soluzione a 350 volte g per pellettare gli sferoidi.
Quindi aspirare il supernatante, lisciviare gli sferoidi e sondare le cellule per la beta-caseina, la ciclina D1 e p120RasGAP mediante gonfiore occidentale. C'è una sorprendente dipendenza dalla differenziazione dalla forza del segnale Rac nelle cellule HC11. Mentre il CRAC1 endogeno è necessario per la differenziazione e bassi livelli di RacV12 attivati mutazionalemente causano un aumento della capacità di differenziazione, alti livelli di RacV12 innescano un blocco di differenziazione e inducono neoplasia.
Quando le proprietà di differenziazione delle cellule EpH4 sono state esplorate in una coltura di matrice 3D, è stato scoperto che la produzione di beta-caseina ha raggiunto il picco da otto a 10 giorni e l'espressione di cyclin D1 era massima a quattro o sei giorni dopo la stimolazione HIP. Per determinare il posizionamento delle singole celle, sono state macchiate con DAPI e immagini con microscopia confocale. La morte cellulare interna e la formazione di lumen cavi sono state osservate nelle mammosfere mentre l'aggiunta di HGF ha portato alla formazione di strutture tubolari.
Qualcuno che esegue questa tecnica per la prima volta dovrebbe tenere a mente che la placcatura delle cellule HC11 è importante. Anche una corretta estrazione delle cellule EpH4 dalla matrice è fondamentale per la quantificazione delle proteine perché eventuali residui influenzeranno la determinazione delle proteine. Questa tecnica può essere utilizzata per indagare altri trasduttori di segnale che possono comportarsi in modo simile.
Se ci sono mutazioni del conducente in un cancro, la loro completa inibizione non sarà necessaria poiché bassi livelli rimanenti indurrebbero effettivamente la differenziazione.
