Modelli animali affidabili sono componenti cruciali della ricerca di base. Il nostro approccio murino consente di rispondere a domande immunologiche sulla meccanistica e cinetica dello sviluppo di lesioni polmonari acute nei mammiferi. Invasività minima, maneggevolezza semplice e buona riproducibilità sono i principali vantaggi di questa tecnica.
Inoltre, con la titolazione della dose, possiamo modulare l'effetto clinico. Questa tecnica rispecchia la situazione clinica dei pazienti con grave lesione polmonare e consente di indagare i meccanismi sottostanti. Conservare il lipolisaccaride, o LPS, in aliquote a una concentrazione di cinque milligrammi per millilitro a meno 20 gradi Celsius.
Per l'instillazione intratracheale, diluire l'LPS scongelato in soluzione salina tamponata con fosfato sterile ad una concentrazione finale di 2.000 microgrammi per millilitro. Tagliare un catetere venoso calibro 22 a una lunghezza di 20 millimetri. Posizionare il mouse nella posizione prona su una tabella a temperatura controllata per mantenere una temperatura corporea di 37 gradi Celsius.
Dopo l'anestesia descritta nel protocollo di testo, applicare lubrificante oftalmico sterile per prevenire l'essiccazione delle cornee in anestesia. Sollevare gli incisivi della testa e del gancio su una barra orizzontale posizionata a circa cinque centimetri sopra il tavolo mentre le sopracciglia rimangono a stretto contatto con il tavolo. Super-estendere il collo con un angolo di 90 gradi rispetto al tavolo.
Posizionare una sorgente di luce fredda sulla pelle sopra la laringe per aiutare a visualizzare le corde vocali e mirare alla trachea. Tenere la lingua con le forcep per raddrizzare la gola per condizioni di intubazione più facili. La corretta visualizzazione e identificazione della laringe sono fondamentali per assicurare il corretto posizionamento intratracheale del catetere.
Una fonte di luce fredda esterna aiuta in questo passaggio. Inserire il catetere di circa 10 millimetri nella trachea. Assicurarsi che l'inserimento non sia troppo profondo, in quanto ciò si tradurrà in instillazione unilaterale di fluido nel bronco principale destro o sinistro.
Se si verifica resistenza della laringe, ritrarre il catetere di alcuni millimetri prima di avanzare di nuovo. Ora, iniettare l'MPBS diluito da LPS utilizzando una pipetta. Il volume iniettato dipende dal peso corporeo del mouse.
Collegare una siringa e aggiungere un bolo di 50 microlitri d'aria per garantire che il volume completo del liquido sia distribuito nei polmoni. Rimuovere lentamente il catetere. Mantenere la parte superiore del corpo del mouse in posizione verticale per 30 secondi per evitare perdite del fluido dalla trachea.
Fissare il topo eutanasiato con nastro adesivo su un tavolo di funzionamento e disinfettare a breve la pelliccia sull'addome con il 70% di etanolo. Aprire attentamente la cavità addominale nella linea mediana con forbici e pinzette. Rimuovere parti dell'intestino per ottenere l'accesso alla vena cava inferiore a destra alla colonna vertebrale nell'aorta addominale.
Individuare le vene renali e inserire una cannula piegata calibro 23 collegata a una siringa millilitro nella vena cava inferiore, direttamente sotto la confluenza delle vene. Aspirare 250 microlitri di sangue e trasferirli in un tubo da 1,5 millilitri riempito con 20 microlitri di soluzione EDTA molare 0,5. Agitare delicatamente per facilitare la miscelazione dell'EDTA e mettere il tubo sul ghiaccio.
Per la lavanda broncoalveolare, preparare tre siringhe millilitre, ognuna con 0,5 millilitri di PBS sterile e 0,1 millilitro di aria. Disinfettare la pelliccia della gola con il 70% di etanolo ed esporre con cura la trachea con forbici e pinzette. Mobilita la trachea e avvolgi una sutura intorno ad essa.
Forare la trachea utilizzando microforbici e inserire un catetere venoso calibro 22, tagliato a una lunghezza di 20 millimetri. Fissare il catetere con una sutura e instillare 0,5 millilitri di PBS sterile e 0,1 millilitri di aria. Aspirare il fluido dopo 60 secondi.
Ripetere la procedura con le due siringhe aggiuntive e raccogliere l'intero aspirato in un tubo da 15 millilitri sul ghiaccio. Aprire con cura il torace con forbici e pinzette per raccogliere i polmoni. Tagliare il diaframma lungo il margine costale e tagliare le costole con due incisioni laterali.
Evitare accuratamente di forare i polmoni. Sollevare lo sterno cranialmente e fissarlo o rimuoverlo. Preparare due siringhe da 10 millilitri con PBS caldo a 37 gradi Celsius.
Fai una piccola incisione nel ventricolo sinistro. Forare il ventricolo destro con una cannula calibro 26. Quindi, sciacquare la circolazione polmonare con un PBS pre-riscaldato.
Essere consapevoli dei polmoni che impallidiscono durante la procedura. Rimuovere il lobo destro dei polmoni e tagliarlo a metà. Snap li congela in azoto liquido seguito da una conservazione a lungo termine a meno 80 gradi Celsius per un'ulteriore espressione genica e analisi proteica.
Rimuovere l'intero polmone sinistro e omogeneizzarlo in una piastra da 48 pozzetti tritando il tessuto con forbici e pinzette. Incubare il tessuto in due millilitri di tampone di digestione a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Eseguire un'ulteriore omogeneizzazione tubazionando accuratamente i pezzi del tessuto polmonare su e giù.
Trasferire i campioni di sangue in cinque tubi FACS millilitro e mescolare delicatamente il sangue con due millilitri di tampone di lysis dei globuli rossi. Mettere i tubi sul ghiaccio e terminare la reazione dopo due minuti aggiungendo due millilitri di PBS ghiacciato. Centrifugare il campione per cinque minuti a 400 volte g e scartare il supernatante.
Resuspend il pellet cellulare con 60 microlitri di tampone FACS e processo per la successiva colorazione FACS secondo protocolli precedentemente descritti. Centrifugare il fluido BAL per cinque minuti a 400 volte g. Aspirare il supernatante e congelarlo in azoto liquido seguito da uno stoccaggio a lungo termine a meno 80 gradi Celsius per ulteriori analisi proteiche.
Dopo aver sospeso il pellet di cellule BAL con due millilitri di tampone FACS freddo, trasferire la sospensione in un tubo FACS da cinque millilitri utilizzando un filtro a rete da 100 micron per trattenere i peli. Dopo aver centrifugato nuovamente il campione, rimorsi il pellet con 60 microlitri di tampone FACS e processo per la successiva colorazione FACS secondo protocolli precedentemente descritti. Ora, trasferire il tessuto polmonare sinistro digerito in un tubo FACS da cinque millilitri utilizzando un filtro a rete da 100 micron per estrarre i grumi.
Terminare il processo di digestione aggiungendo due millilitri di tampone FACS ghiacciato prima di centrifugare il campione per cinque minuti a 400 volte g. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet con 60 microlitri di tampone FACS e processo per la successiva colorazione FACS secondo protocolli precedentemente descritti. Per un'analisi FACS, aggiungere 20 microlitri di soluzione di blocco degli anticorpi CD16/CD32 a 60 microlitri di cellule in un tubo da cinque millilitri.
Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 15 minuti per bloccare il legame non specifico dell'immunoglobulina ai recettori Fc. Nel frattempo, preparare un master mix con tampone FACS e anticorpi, come descritto nel protocollo di testo. Dopo il blocco, non lavare le cellule.
Aggiungere 20 microlitri di miscela di master anticorpi per campione per ottenere un volume finale di 100 microlitri. Incubare i campioni per 20 minuti, al buio, a quattro gradi Celsius. Lavare ogni campione con un millilitro di tampone FACS e centrifuga come prima.
Scartare il supernatante e resospendare il pellet con tampone FACS alla concentrazione cellulare appropriata per le misurazioni FACS. Infine, aggiungere un numero fisso di perline di taratura accoppiate al fluorocromo disponibili in commercio a ciascun campione per determinare il numero assoluto di cellule. Eseguire la citometria a flusso utilizzando la strategia di gating mostrata nel protocollo di testo per sangue, BAL e cellule tissutali.
24 e 72 ore dopo l'instillazione intratracheale, l'espressione di TNF-alfa nel tessuto polmonare è stata significativamente migliorata, raggiungendo un aumento sostenuto e più di 50 volte rispetto agli animali di controllo. L'invasione dei leucociti nei tessuti e nello spazio alveolare è un segno distintivo e caratteristico per lo sviluppo di lesioni polmonari acute. L'analisi FACS ha rivelato una significativa infiltrazione di granulociti neutrofili nell'interstizio polmonare, con un numero assoluto di cellule che è aumentato di quasi nove volte rispetto ai controlli dopo 24 ore.
Il numero assoluto di granulociti neutrofili è leggermente diminuito dopo 72 ore, tuttavia, l'aumento del fattore rispetto ai controlli è rimasto. Coerentemente con l'infiltrazione di granulociti neutrofili interstiziali, anche l'espressione di MMP-9 nell'intero tessuto polmonare è stata significativamente aumentata durante il periodo di osservazione totale. I granulociti neutrofili sono stati aumentati non solo nel tessuto polmonare, ma anche nel liquido BAL.
L'aumento di piega rispetto agli animali di controllo era più pronunciato che nel tessuto polmonare. L'edema polmonare dovuto a grave compromissione della barriera alveolocapillare è patognomonico per lo sviluppo di lesioni polmonari acute. L'analisi del contenuto di albume nel fluido BAL da parte di ELISA ha rivelato una significativa perdita della funzione barriera a 24 ore e 72 ore dopo l'instillazione LPS.
Un corretto posizionamento del catetere è fondamentale per l'instillazione bilaterale dell'LPS. Spesso, i cambiamenti nei modelli respiratori, come tosse o ansimante, indicano una corretta instillazione intratracheale del fluido. A seguito dell'induzione della lesione polmonare acuta, una serie di passaggi successivi, come l'analisi FACS, pcr, un rilevamento proteico, possono essere eseguiti per rispondere alle rispettive domande di ricerca.
