Questo protocollo è adatto per indagare da dove provengono le proteine presnaptiche: corpi cellulari o assoni. E come le proteine presnaptiche si accumulano nelle presnapsi in modo organizzato durante la formazione della sinapsi. Questa tecnica può indurre migliaia di rapasi allo stesso tempo, e non utilizza alcun apparato speciale per mantenere gli assoni in coltura permettendo un'analisi efficiente della formazione di molte presnapsi negli assoni.
Insieme alla studentessa, Honami, a dimostrare questa procedura sarà Rie Ishii, una studentessa universitaria nel mio laboratorio. Iniziare questa procedura con l'eutanasia del mouse come descritto nel protocollo di testo. Sezionare l'addome per ottenere embrioni E16.
Rimuovere accuratamente il cervello dagli embrioni con l'aiuto di forcep a punta fine e trasferirli in piatti di coltura cellulare da 60 millimetri contenenti quattro millilitri di soluzione di sale tamponato HEPES o HBSS. Rimuovere le meningi e tagliare il bulbo olfattivo. Separare i cortici da ogni emisfero cerebrale utilizzando le punte fini delle forcep al microscopio stereo e trasferirli in un altro piatto da 60 millimetri contenente HBSS fresco.
Utilizzare almeno da tre a cinque embrioni per ogni coltura separata di palla neuronale. Tagliare i cortici in piccoli pezzi con forbici a molla microdissettanti in un cappuccio di coltura cellulare a flusso laminare. Ora, trasferisci cortici tritati in un tubo da 15 millilitri.
Tripinare i cortici tritati in quattro millilitri dello 0,125% di tripside in HBSS per 4,5 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Trasferire gli aggregati cellulari in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS da una pipetta di trasferimento sterile. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti prima di ripetere questo passaggio ancora una volta.
Quindi trasferire gli aggregati cellulari in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di mezzo NGB, 0,01%DNasi I e siero del 10% di cavallo. Triturare i cortici tripsinato tubazioni ripetutamente su e giù da tre a cinque volte utilizzando una pipetta Pasteur in vetro fine lucidato dal fuoco. Per preparare le sfere neuronali, regolare la densità cellulare nella sospensione cellulare a un milione di cellule per millilitro utilizzando il mezzo NGB.
Aggiungere sette millilitri di PBS alla parte inferiore dei piatti della coltura. Coltura dei neuroni corticali come 10 gocce appese di microliter contenenti 10.000 cellule per goccia all'interno dei coperchi superiori dei piatti di coltura di 10 centimetri. Conservare i piatti in un'incubatrice per tre giorni a 37 gradi Celsius con 5%CO2 in condizioni umidificate per consentire la formazione di palla neuronale.
Rivestire poli-L-lisina o PLL sulla copertura in vetro con perline di paraffina in stoviglie da 60 millimetri utilizzando una soluzione PLL da 15 microgrammi per millilitro nel tampone di borato. Conservarli per almeno un'ora in un incubatore di CO2 a 37 gradi Celsius. Dopo il lavaggio quattro volte con PBS, trasferire i coperchi rivestiti in PLL su una piastra a quattro porri contenente 350 microlitri di mezzo NGB con tre AraC micromolare in ogni pozzo.
AraC viene aggiunto al supporto per uccidere le cellule divisorie. Incubare le piastre a quattro pozzi contenenti la copertura rivestita in PLL scivola nell'incubatore di CO2 per almeno 20 minuti per garantire che la temperatura del mezzo raggiunga i 37 gradi Celsius prima di trasferire le sfere neuronali. A DIV 3 quando le sfere neuronali si formano molto bene, trasferiscile su scivolamenti di copertura rivestiti in PLL.
All'interno della piastra a quattro po', aggiungere cinque sfere neuronali per pozzo. Al DIV 11 trasferiscono 20 microlitri dalla sospensione di particelle magnetiche rivestite di streptavidina a un tubo di microcentrifugo. Immobilizzare le perline di un apparecchio fatto a mano attaccato con magneti permanenti al neodimio e lavare tre volte con 100 microlitri di PBS-MCBC in tubi microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Dopo aver rimosso completamente PBS-MCBC dalle perline, aggiungere un volume predeterminato di materiale LRRTM2 alle perline lavate. Incubare la miscela usando un rotatore a quattro gradi Celsius per una o due ore. Dopo l'incubazione, lavare le perline due volte con 100 microlitri di PBS-MCBC.
Quindi, lavare le perline con 100 microlitri di mezzo NGB. Resuspend le perline LRRTM2 in 50 microlitri di mezzo NGB per l'applicazione alla coltura della sfera neuronale. Ora taglia l'estremità di una punta gialla con un angolo di 45 gradi con una lama di rasoio al microscopio stereo.
Mettere l'estremità gialla della punta sull'area del corpo cellulare di una palla neuronale e rimuovere i corpi cellulari per aspirazione. Applicare l'LRRTM2 e controllare le perline sulla coltura della sfera neuronale. Quindi immergere le perline sul fondo delle piastre della coltura della sfera neuronale per un minuto usando magneti di ferrite per iniziare la formazione pre-sinapsi.
Questa procedura assicura di touchdown di tutte le perline contemporaneamente. Fissare e macchiare i neuroni nella coltura della palla neuronale dopo la formazione pre-sinapsi con perline come descritto nel protocollo di testo. Cattura il contrasto differenziale delle interferenze e le immagini di immunofluorescenza sotto un microscopio fluorescente invertito con una telecamera CCD raffreddata che utilizza un obiettivo ad immersione dell'olio 60X.
Misurare l'intensità dell'immunofluorescenza nelle pre-sinapsi nell'assone. Utilizzare intensità di immunofluorescenza della regione di interesse sulle perline. Meno l'intensità della regione delle perline off divisa per l'intensità assonale, lungo 20 micron dalle perline.
Meno intensità dello sfondo. Questa intensità di rapporto fornisce l'indice di accumulo proteico. Per quantificare il livello di accumulo di una particolare proteina in una presnapsi indotta con perline LRRTM2, selezionare sempre l'area che è due campi visivo o più a parte il corpo cellulare.
Per una misurazione accurata, scegliere cinque diversi campi assonali per coverlip. Qui è mostrata l'applicazione delle perline LRRTM2 nella coltura della sfera neuronale all'accumulo indotto di Munc18-1 indotto da DIV 11 nelle rapasi degli assoni delle sfere neuronali. Le perline sugli assoni delle sfere neuronali sono visibili nelle immagini della microscopia di fase.
E l'accumulo di proteine presnaptiche è osservato dalle immagini di immunofluorescenza. Anche negli assoni che vengono rimossi corpi cellulari, l'accumulo di Munc18-1 è stato osservato sotto le perline, simile agli assoni di sfere neuronali con corpi cellulari. Quando la regione periferica del foglio assonale è stata analizzata da lenti oggettive ad alto ingrandimento, vGlut1 e Munc18-1 si sono accumulati chiaramente nelle rapasi degli assoni sotto le perline con e senza corpi cellulari.
Gli esperimenti sui corsi di tempo hanno dimostrato che l'accumulo di vGlut1 nelle presnapsi è aumentato significativamente a 30 minuti. D'altra parte, l'accumulo di Munc18-1 ha iniziato ad aumentare significativamente a due ore e ha raggiunto un altopiano a quattro ore. Questi dati indicano che la proteina sinaptica vescicola vGlut1 si accumula nelle presnapsi prima della proteina della zona attiva Munc18-1.
L'accumulo di Munc18-1 nelle presnapsi dei neuroni Fmr1-KO è aumentato 1,5 volte di più di quelli di tipo selvaggio, indicando il coinvolgimento dell'FMRP nell'accumulo di Munc18-1. L'inibitore della sintesi proteica, l'anisomicina, ha soppresso l'accumulo di Munc18-1 in modo significativo negli assoni con e senza corpi cellulari. Ciò indica che l'accumulo dipende dalla sintesi proteica.
Pipettare le cortici tripsinato utilizzando una pipetta Pasteur in vetro fine lucidato dal fuoco è un passo importante. Gli sperimentatori preparano le pipette lucidate dal fuoco con due o tre diametri diversi e scelgono una pipetta con un diametro appropriato. Utilizzando questa procedura, il rilascio sinaptico da presnapsi indotte da perline LRRTM2 viene misurato mediante imaging dal vivo.
Questo metodo aggiuntivo risponderebbe se la sintesi proteica negli assoni è coinvolta nella regolazione del rilascio sinaptico. Utilizzando questo metodo, i ricercatori esaminano come le proteine presnaptiche si accumulano nelle presnapsi in modo organizzato, così come la posizione della fonte di proteine presnaptiche.
