Questa nuova tecnica per l'imaging mesoscopico in tempo reale di tracce florescenti di CSF attraverso il cranio intatto di topi vivi può essere utilizzata per valutare il trasporto linfomanico. Il vantaggio principale è che questa tecnica consente misurazioni dinamiche di traccianti intracisternali in vivo a una frazione del costo di altre modalità di imaging. Le procedure necessarie per posizionare la piastra della testa sulla cisterna magna cannula sono semplici e minimamente invasive ma richiedono una pratica corretta.
La dimostrazione visiva dei passaggi critici di questo metodo è necessaria per massimizzare la qualità dell'immagine e consentire confronti riproducibili tra topi diversi e gruppi sperimentali. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi bagnato il collo e la testa con acqua sterile e radere la pelliccia inumidita. Pulire la pelle esposta con un tampone alcolico per rimuovere eventuali capelli residui e posizionare il mouse in un telaio stereotattico sopra un tampone a temperatura controllata.
Applicare un unguento sugli occhi degli animali e pulire la pelle esposta con un tampone di clorexidina. Dopo 2 minuti rimuovere la clorexidina con una salvietta alcolica e applicare una soluzione di iodone. Quando lo iodone ha essiccato iniettare analgesia sottocutanea nella parte superiore del cranio e del collo.
Partendo dalla parte del collo che copre la crosta occipitale, fare un taglio a metà linea nella pelle sovrastante proseguendo rostralmente verso la linea intraorbitale. Estendere l'incisione lateralmente al bordo dove il muscolo temporale si inserisce nel cranio e rimuovere tutta la pelle dell'incisione fusiforme per esporre sia le ossa frontali che parietali. Irrigare il cranio con soluzione salina sterile e utilizzare tamponi di cotone per pulire la superficie fino a quando non è priva di detriti e capelli.
Dopo aver inserito la cisterna magna cannula applicare una miscela di cemento dentale e colla cianoacrilato sul lato ventrale della piastra della testa intorno al bordo. Posizionare la piastra della testa sul cranio in modo che il bordo anteriore della piastra si allinei con la punta posteriore dell'osso nasale e il bordo posteriore si allinei con l'aspetto anteriore dell'osso interparietale assicurandosi che la sutura sagittale sia centrata e dritta rispetto alla finestra. È importante assicurarsi che la piastra della testa sia fissata e che non ostruisca il campo visivo della cannula cisterna magna.
Utilizzare un paio di gocce di acceleratore di colla per fissare la posizione della piastra della testa e riempire eventuali spazi rimanenti con la miscela di cemento. Incollare la cisterna magna cannula sulla piastra della testa e utilizzare la piastra della testa per posizionare il mouse nel supporto della testa in posizione fissa. Posizionare con cura il mouse e la pompa di infusione attaccati alla cannula su un carrello per il trasporto al macroscopio e posizionare il supporto della testa sul palco del macroscopio.
Assicurarsi che la linea dalla pompa della siringa alla cisterna magna cannula non sia tesa e che non abbia nodi. Osservare la frequenza respiratoria e la colorazione rosa delle membrane del muco per confermare una buona ossigenazione. Accendi la fotocamera del macroscopio e il diodo che emette luce e avvia la modalità live.
Regolare l'ingrandimento del campo di imaging in modo che la sutura nasofrontale nella parte superiore del campo e la sutura lambdoide nella parte inferiore possano essere chiaramente visualizzate. Una volta in posizione nastro il supporto della testa allo stadio macroscopio e mettere a fuoco il macroscopio sul cranio esposto fino a quando il piano focale non si trova sui lati laterali delle ossa parietali posteriori alle suture coronali. Per l'infusione di tracciante CSF impostare la pompa per infusione alla velocità e al volume appropriati e impostare la lunghezza d'onda di eccitazione e il tempo di esposizione appropriati per il tracciante per ciascun canale.
Quindi verificare che la funzione di attivazione sul macroscopio sia corretta prima di avviare contemporaneamente l'infusione di tracciante e l'imaging. Durante l'imaging le suture naso frontali, sagittali, coronali e lambdoidi possono essere facilmente identificate. Una volta che il tracciante CSF è stato infuso nella cisterna magna, la fluorescenza del tracciante viene osservata per la prima volta in grandi pozze di CSF subaracnoide alla cisterna olfattofrontale e alla cisterna quadrigeminale vicino alla rientranza pineale e infine circondando le arterie cerebrali centrali.
I traccianti CSF entrano quindi nel loro cervello lungo gli spazi vascolari peri dei rami pettorale corticali dell'arteria cerebrale centrale. L'imaging di trasporto CSF dopo una lesione cerebrale traumatica rivela tracciante inizialmente alla cisterna olfattofrontale, ma l'afflusso linfomanico lungo gli spazi perivascolari corticali è completamente abolito sul lato della lesione. L'analisi quantitativa nelle immagini in vivo dimostra che l'area di afflusso ipsilaterale è diminuita di quasi un terzo rispetto all'emisfero contralaterale.
Per evitare artefatti di movimento e i cambiamenti nel piano focale ricordarsi di fissare correttamente la piastra della testa e il supporto della piastra della testa e controllare il livello di anestesia dell'animale. Dopo l'esperimento i risultati dell'imaging in vivo possono essere ulteriormente convalidati quantificando la penetrazione del tracciante utilizzando l'attuale Questa tecnica consente lo studio del sistema glimphatico in modo fisiologico e minimamente invasivo e può aiutare ad affrontare le domande future sull'idrodinamica del CSF in salute e malattia.
