L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare i vasi sanguigni nel cervello e l'ipofisi dei pesci teleost, e usiamo la perfusione cardiaca con un fissatore contenente DiI nella specie modello medaka. Quindi questa tecnica che è semplice ed efficiente aiuterà a rispondere a importanti domande riguardanti l'anatomia vascolare nel cervello e l'ipofisi del pesce teleost, così come la relazione tra neuroni o cellule endocrine e vasi sanguigni. Alcuni vantaggi di questa tecnica includono una preparazione semplice e veloce e la sua adattabilità alle specie ittiche teleost.
Per preparare un supporto per pesci, tagliare un pezzo di polistirolo a una lunghezza di cinque centimetri, una larghezza di tre centimetri e uno spessore di due centimetri e incollare il polistirolo a un piatto di plastica di nove centimetri di diametro. Quindi usa un bisturi per fare un buco a forma di barca di tre centimetri nel polistirolo. Per preparare il sistema di perfusione, aggiungere una cannula di plastica lunga da 30 a 50 centimetri all'estremità dell'ago del sistema di perfusione.
Per preparare pipette di vetro di cinque centimetri, utilizzare un estrattore di pipetta per allungare i singoli capillari di vetro secondo le istruzioni del produttore. Prima di iniziare la dissezione, caricare una siringa da 10 millilitri con la soluzione dii-fissativa preparata e posizionare un ago con una cannula all'estremità della siringa. Quindi utilizzare diversi pezzi di nastro posizionati in diversi orientamenti per fissare la siringa al banco e regolare la posizione del microscopio e del sedile per ottenere una buona posizione per la dissezione e per premere il pistone della siringa con il gomito.
Quindi, posizionare un pesce eutanasiato nell'addome del detentore del pesce lato verso l'alto e fissare la testa e la coda con i perni. Utilizzare le forbici per tagliare orizzontalmente lo strato superficiale della pelle per aprire l'addome anteriore e utilizzare le flessori per rimuovere la pelle sopra il cuore fino a ottenere un chiaro accesso al ventricolo e al bulbo arterioso. Aggiungere un tubo di vetro all'estremità del capillare e rompere la punta della pipetta.
Portare il tubo di vetro vicino al ventricolo e aggiungere la pressione del gomito al pistone della siringa per forzare il liquido mentre si fissa il ventricolo cardiaco con la pipetta. Quindi perforare immediatamente il seno velenoso con le forcep per rilasciare il sangue dalla circolazione. Dal ventricolo, regolare l'angolo della pipetta di vetro per localizzare l'ingresso del bulbus arteriosus e spostare l'apertura della pipetta all'interno del bulbus arteriosus.
Quindi aggiungere pressione alla siringa per altri 30-60 secondi mantenendo la pipetta all'interno del bulbo arterioso. Per un'etichettatura ottimale di tutti i vasi sanguigni è fondamentale perfondere nel bulbo arterioso abbastanza a lungo da sostituire tutto il sangue con la soluzione dii-fissante. Dopo circa 60 secondi di perfusione, quando non si osservano più perdite di sangue, rimuovere la pipetta di vetro e gli aghi dal pesce e raccogliere il cervello e l'ipofisi in paraformaldeide fresca al 4% per due ore a temperatura ambiente al buio.
Quindi risciacquare i tessuti due volte in PBS fresco per 10 minuti per lavaggio prima di preparare i campioni per l'imaging. Dopo l'iniezione cardiaca di una soluzione fissativa contenente DiI come dimostrato, i vasi sanguigni etichettati possono essere osservati su fette di tessuto mediante microscopia stereo fluorescente o su tutto il tessuto mediante microscopia confocale. Si noti che se la soluzione viene iniettata nel ventricolo cardiaco al posto del bulbus arteriosus o se la soluzione viene iniettata con una pressione troppo bassa e /o per un periodo troppo breve, si osserverà un'etichettatura inadeguata dei vasi.
Inoltre, quando si imaging lo stesso tessuto con gli stessi parametri di imaging, si può osservare una diminuzione dell'intensità di etichettatura dopo diversi giorni, con il segnale che appare più diffuso all'interno del campione di tessuto. Le fette di tessuto provenienti da linee transgeniche all'interno delle quali le cellule di interesse esprimono proteine fluorescenti reporter possono essere ulteriormente etichettate per proteine specifiche di interesse utilizzando protocolli standard di immunofluorescenza che consentono lo studio delle interazioni tra i vasi sanguigni e altri tipi di cellule. È importante raggiungere il bulbus arteriosus.
Quando ciò viene ottenuto, l'aggiunta di pressione al pistone della siringa dovrebbe indurre un'espansione del bulbo confermando una procedura riuscita. Questa tecnica può essere utilizzata per indagare l'interazione tra cellule endocrine e vasi sanguigni nell'ipofisi del teleost in generale, ma forse più specificamente per indagare possibili differenze o somiglianze tra i sistemi portale nel teleost e nei mammiferi. Poiché questo uso politico ha precauzioni di composti tossici e volatili come l'uso di una maschera antigas e di una stanza ventilata, dovrebbe sempre essere preso quando si eseguono queste procedure.
