Il software e il supporto tecnico sono per gentile concessione di correlata Solutions Incorporated (www.correlatedsolutions.com).

NOTA: Le procedure descritte qui di seguito sono state eseguite come parte di un protocollo approvato dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso la University of South Carolina a Columbia, South Carolina. 1. Acquisizione e dissezione dei tessuti <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima di dissezione dei tessuti. Forbici chirurgiche autoclave e pinza sottile standard e lame chirurgiche sotto pressione di 15 psi e la temperatura di 121 ° C per 15 min. </li><li> Acquisire una serie di suino fresca (7 mesi di età maschi Landrace, 60-70 kg) reni con dell&#39;aorta intatto da un mattatoio locale. Tessuto trasporto al laboratorio in soluzione ghiacciata 1% tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Immediatamente all&#39;arrivo, isolare l&#39;aorta addominale dal tessuto circostante con le forbici chirurgiche e pinze. </li><li> Lavare il recipiente tre volte utilizzando una siringa da 50 ml riempita con PBS (pH 7,2). Utilizzando le forbici e pinze, rimuovere la maggior quantità di tessuto perivascolare come possIBLE senza compromettere l&#39;integrità del campione. </li><li> Posizionare verticalmente una lametta affilata sulla sezione centrale del vaso e assicurarsi che è perpendicolare all&#39;asse longitudinale dell&#39;imbarcazione. Creare due campioni anello ciascuno con una larghezza di circa 20 mm, applicando tre tagli circonferenziali sequenziali con la lama di rasoio. </li><li> Posizionare verticalmente una lametta affilata su un campione anello tale che la lama è orientato in direzione radiale. Applicare una forza acuta per produrre un taglio radiale, che si traduce in un campione a forma di striscia per prove meccaniche uniassiale. Trasferire il campione in una piastra di Petri 100 mm vetro e immergere in PBS fino all&#39;applicazione di pezzatura superficie. Ripetere l&#39;operazione per il secondo campione anello. </li></ol> 2. Creazione di Surface Speckle modello <ol><li> Collegare l&#39;aerografo alla valvola di pressione. </li><li> Regolare il diametro ugello dell&#39;aerografo per produrre macchie di 60-100 micron (gamma appropriata per il diametro degli ugelli dovrebberoessere determinata da studi preliminari). </li><li> Versare circa 2 ml di tessuto nero tintura marcatura nell&#39;alimentatore gravità della aerografo. </li><li> Posizionare l&#39;aerografo a circa 0,5 m di distanza dal campione. </li><li> Togliere il campione dalla piastra di Petri. Spray marcatura tessuto colorante sulla superficie intimale del campione per circa 5 secondi sotto una pressione di spruzzatura 100 psi. Ripetere tre volte per assicurare che il speckle ricopre uniformemente la superficie del campione. </li></ol> 3. Prestazioni di esperimenti <ol><li> Fissare ciascuna estremità del campione ad una striscia di plastica (1 cm di spessore di larghezza x 1 cm di lunghezza x 0,5 cm) con un adesivo tissutale. Posizionare il campione su un tagliere di tessuto. Posizionare il campione tale che si trovi e misurare le sue dimensioni con un calibro digitale. </li><li> Avviare controlli di sistema per prove meccaniche. Sul sistema controlla schermata principale, selezionare &quot;forma d&#39;onda&quot; sulla barra delle applicazioni si trova nella scheda &quot;Impostazioni&quot;. </li><li> Anno Dominisolo la posizione dell&#39;impugnatura superiore del tester meccanico a -4 mm (4 mm estensione rispetto alla posizione iniziale indicata nel sistema). Garantire Delicatamente una striscia di plastica (in allegato al modello 3.1) nella morsa superiore del tester meccanico e consentire il campione di pendere liberamente. Utilizzare il calibro digitale per garantire che la distanza tra il campione e l&#39;impugnatura superiore è inferiore a 2 mm. </li><li> Regolare manualmente la posizione dell&#39;impugnatura inferiore in modo che l&#39;estremità libera del campione può essere assicurato senza estensione. Garantire delicatamente la striscia di plastica fissato all&#39;estremità libera del campione nella morsa inferiore del tester meccanico. <ol><li> Utilizzare il calibro digitale per garantire che la distanza tra il campione e l&#39;impugnatura inferiore è inferiore a 2 mm. Zero la cella di carico del sistema. Misurare la lunghezza del campione e usare questo come la lunghezza di riferimento per il calcolo dei ceppi circonferenziali globali. </li></ol></li><li> Inserisci il protocollo prove meccaniche. Il protocollo utilizzato in tsua dimostrazione comporta 4 cicli spostamento uniassiale che estendono la lunghezza del campione del 18% ad una velocità di spostamento di 0,01 mm / sec. </li><li> Intermittently spruzzare PBS sul campione durante il protocollo di test rimanente per assicurare che rimanga idratato. </li><li> Montare la fotocamera (fotocamera da 5 mega pixel, mm 100 dell&#39;obiettivo, dimensione dei pixel di 3.49 micron) su un treppiede che è posizionato a 1,5 m dal telaio di carico. Assicurare la fotocamera e la superficie del campione sono perpendicolari impostando la fotocamera al campo più basso disponibile di profondità e di manipolare il suo allineamento tale che l&#39;intero campo visivo è a fuoco. </li><li> Aprire il software di acquisizione delle immagini. </li><li> Selezionare &quot;PGR-2&quot; nell&#39;opzione &quot;Selezione del sistema&quot;. </li><li> Selezionare il percorso di progetto per salvare le immagini da analizzare. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Time Square&quot; e specificare l&#39;intervallo di acquisizione come 5 sec. </li><li> Regolare l&#39;esposizione, apertura numerica, e messa a fuoco dell&#39;obiettivo in modo da ottenere una visione chiara del campione. </li><li> Regolare la posizione di LED per fornire un&#39;adeguata illuminazione sul campione. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Start&quot; nel software di cattura delle immagini per ottenere un&#39;immagine della superficie del campione. </li><li> Aprire il software di analisi delle immagini. </li><li> Importare l&#39;immagine ottenuta. Zoom su un individuo macchiolina, e poi contare il numero di pixel all&#39;interno di questo individuo macchiolina. Nota: Identificare una macchiolina nera rappresentante. Definire la dimensione speckle come la distanza lineare tra pixel su entrambi i lati del speckle che hanno valori elevati simili. Per una dimensione speckle accettabili, il numero di pixel in tutta la larghezza di un speckle tipica dovrebbe essere maggiore di 3 pixel. Per migliorare la risoluzione spaziale delle misurazioni, la maggior parte delle macchie dovrebbero avere più di 5-7 pixel lungo la larghezza del speckle, quando possibile. Così, un speckle tipico per questo caso sarebbe compreso tra 10 micron sulla minima e 23 micron al più grande dimensione lineare. Per determinare un sottoinsieme adeguatodimensioni, un sottoinsieme tipico deve avere almeno 3 bianco e 3 macchie nere in tutta la sua larghezza. Se una macchiolina tipico è di 5 pixel a dimensione lineare, quindi ogni 31x31 sottoinsieme sarebbe almeno 105 micron di dimensione lineare. La spaziatura fra i centri sottoinsieme deve essere almeno 1/6 della dimensione lineare. Così, per una dimensione 31x31 sottoinsieme, la distanza è 5 pixel che rappresenta 18 micron in linea d&#39;aria. </li><li> Dopo aver verificato la qualità di speckle, contemporaneamente fare clic sull&#39;icona &quot;Esegui&quot; nel sistema e l&#39;icona &quot;Start&quot; nel software di cattura delle immagini per avviare il test. </li><li> Scatto di una serie di immagini in tutto il test utilizzando il software della fotocamera e la cattura delle immagini. </li></ol> 4. Procedure di pulizia dopo l&#39;esperimento <ol><li> Mettere il campione scartato in sacchetto di rischio biologico e chiudere il sacchetto. Chiamare il Dipartimento di Salute Ambientale e Sicurezza (EHS) presso la University of South Carolina per il corretto smaltimento. </li><li> Preparare una fosfatisoluzione disinfettante libera con un rapporto di diluizione 1:64 di detergente disinfettante acqua distillata. Immergere gli strumenti chirurgici in questa soluzione per 20 min. </li><li> Sciacquare a fondo gli elementi indicati nel 4.2 con acqua distillata. Asciugare gli strumenti con un tovagliolo di carta e poi li spruzzare con una soluzione di etanolo al 70%. Ancora una volta gli strumenti chirurgici asciugare con un tovagliolo di carta e rimetterli nella casella degli strumenti chirurgici. </li></ol> 5. Analisi dell&#39;immagine per misurare il ceppo di campo locale <ol><li> Aprire il software di analisi delle immagini. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;immagini Speckle&quot;, selezionare tutte le immagini che devono essere analizzati. </li><li> Clicca su strumento rettangolo e selezionare l&#39;area di interesse nella prima immagine. </li><li> Immettere formato sottoinsieme di 41 × 41 pixel e dimensione del passo 5 pixel. </li><li> Fare clic su Start scheda analisi del software, selezionare l&#39;interpolazione come ottimizzato 8-trappola; selezionare il criterio differenze al quadrato zero normalizzati e pesi sottoinsieme di opzione ai gaussiana. </li><li>Impostare le opzioni di soglia predefinita nel software. </li><li> Fare clic sulla scheda secondaria post-elaborazione in tab analisi inizio. Clicca opzione ceppo calcolo e lasciare le dimensioni del filtro e tipo di filtro come predefinito nel software. Selezionare tensore tipo Lagrange. </li><li> Selezionare la scheda dati e quindi selezionare qualsiasi immagine analizzata per la visualizzazione del campo di deformazione superficiale. </li></ol>

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Gli autori non hanno potenziali conflitti di interesse.

Sebbene studi precedenti hanno utilizzato una vasta gamma di metodi di video-dye di monitoraggio per valutare tensione campione 18,20,21,23,24, il nostro obiettivo attuale è quello di fornire una metodologia completa per due prove di trazione uniassiale con 2D-DIC per la valutazione di tensioni superficiali su campioni di tessuto vascolare. Con una fotocamera ad alta risoluzione e software di analisi dell&#39;immagine in-house, il campo di deformazione può essere misurata in una regione superficiale predeterminata come il campione subisce carico monoassiale. Di particolare rilevanza per prove meccaniche del tessuto vascolare, la tecnica presentata può essere adattato direttamente per valutare ceppi superficiali planari test biassiali che a loro volta consentono l&#39;identificazione delle proprietà dei materiali costitutivi. Per facilitare l&#39;analisi di correlazione dell&#39;immagine digitale, un speckle viene applicata alla superficie del campione. La vernice utilizzata per pezzatura è un colorante marcatura tessuto che aderisce facilmente alla maggior parte delle superfici dei tessuti molli. Per ottenere unbuona qualità del contrasto e corretta densità del speckle, una dimensione ottimale speckle di 60-100 micron e la distanza di spruzzatura di 0,5 m sono realizzati regolando il diametro dell&#39;ugello dell&#39;aerografo e la distanza tra il campione e l&#39;aerografo. La dimensione macchiolina utilizzato è direttamente correlata alla risoluzione delle misure risultanti 23,25. Ogni macchiolina deve essere campionata da almeno 3-5 pixel per ottenere immagini di correlazione accettabile. Dato un mm campo visivo 22 mm × 18 e la dimensione speckle utilizzato, la risoluzione dell&#39;esperimento presentato è 9 micron / pixel. Un regime di carico di 0.01 mm / sec è utilizzato per prove meccaniche in modo da ottenere una serie di stati di equilibrio deformato quasi-statica per tessuto vascolare 26,27. Poiché la fotocamera e cella di carico ad alta fedeltà sono entrambi estremamente sensibili alle vibrazioni, ci dovrebbero essere minimo movimento durante l&#39;esperimento; anche se piccolo, corpo rigido movimento della fotocamera / campione può verificarsi e wmisurazioni 2D-DIC-based malato confondere. Analogamente, deformazione campione può verificarsi a causa di disidratazione dei tessuti, quindi è importante che PBS viene applicato tramite test di promuovere l&#39;accuratezza di 2D-DIC. Per 2D-DIC, specifiche richieste includono la dimensione sottoinsieme e la dimensione del passo utilizzato in algoritmo immagine corrispondente 22. Per ottenere risultati accurati con polarizzazione trascurabili, almeno 3 nero e 3 macchie bianche dovrebbero essere presenti in ogni sottoinsieme, con ogni speckle campionata mediante almeno 3-5 pixel. Ciascun punto dati in uscita fornisce informazioni media su una scatola che corrisponde alla dimensione sottoinsieme (41x41 pixel), considerata la risoluzione spaziale dell&#39;esperimento. La distanza tra due punti di dati in termini di passo è da 5 pixel in questo esperimento. Al fine di massimizzare la precisione nelle misure di deformazione spostamento speckle / superficie, un metodo di interpolazione spline 8-tap è applicata per ottenere valori di intensità, sub-pixel accurati. Il meth 8-tapod è leggermente più elevata precisione per ottenere ceppi rispetto ai risultati ottenuti utilizzando un rubinetto 4 o 6-tap filtro di interpolazione. Il criterio di correlazione &quot;differenze al quadrato normalizzati&quot; è stato selezionato per l&#39;abbinamento in quanto non è influenzato da un cambiamento di scala a illuminazione (ad esempio, quando un sottoinsieme deforme è del 30% più luminoso di riferimento). Questa scelta è la selezione predefinita nel software e di solito offre la migliore combinazione di flessibilità e risultati 28. Ponderazione sottoinsieme, che controlla come i pixel all&#39;interno del sottoinsieme sono ponderati nel processo di corrispondenza, è stato selezionato come gaussiana. Con pesi uniformi, ogni pixel nel sottoinsieme è considerato altrettanto; Pesi Gaussiane forniscono la migliore combinazione di risoluzione spaziale e risoluzione spostamento. Coefficienti di variazione del campo di deformazione superficiale sono state calcolate con il software di analisi delle immagini in-house e utilizzato per quantificare il grado di deformazione eterogeneità. Il coefficiente di variazione del campo di deformazione in entrambe le direzioni circonferenziali e longitudinale diminuiva con l&#39;aumentare strain circonferenziale globale, che è stato precedentemente osservato in analoghe prove meccaniche su altri tipi di tessuti vascolari (risultati non pubblicati). Sulla base di questa tendenza persistente, è ragionevole aspettarsi che i campi di deformazione superficiale potrebbero sufficientemente omogeneizzare sopra un certo grado critica di estensione tale che le misurazioni globali e locali convergono. Tuttavia, è probabile che questo valore critico è tessuto- e specifico campione, sostenendo così l&#39;uso di misure di deformazione locale per l&#39;identificazione accurata delle proprietà dei materiali costitutivi. Diversi limiti devono essere considerati per una corretta interpretazione della nostra metodologia e dei risultati presentati. Abbiamo prescritto una gamma moderata di deformazione circonferenziale globale, così le nostre realizzati magnitudo deformazione locali in entrambe le direzioni circonferenziale e longitudinale erano significativamente più bassi<html> rispetto ai valori osservati in vivo. Inoltre, è stata valutata la risposta meccanica monoassiale sotto un unico orientamento del campione, e quindi generare dati sufficienti per identificare le proprietà dei materiali costitutivi di tessuto vascolare 29,30. Tuttavia, il nostro obiettivo non è quello di condurre una completa analisi meccanica dell&#39;aorta suina, ma piuttosto a dimostrare un protocollo sperimentale di coppia 2D-DIC ad un test meccanici uniassiale sui tessuti molli. La tecnica qui presentata può essere facilmente estesa ad biassiale prove meccaniche e quindi la quantificazione delle proprietà meccaniche costitutive di tessuti vascolari 31-33. Il metodo 2D-DIC cattura solo un campo di deformazione piana corrispondente alla superficie del campione. Quando il campione si deforma fuori piano, o quando il campione è una geometria non planare (ad esempio, vasi sanguigni), imaging stereo-visione e una tecnica 3D-DIC può essere applicato per la misura della deformazione completa 23,25. nt &quot;&gt; In sintesi, la presente manoscritto fornisce informazioni dettagliate sulla metodologia di integrare prove di trazione uniassiale e correlazione di immagini digitali per caratterizzare la risposta meccanica del tessuto vascolare nativa. Il metodo presentato in questo studio può essere facilmente adattato per la caratterizzazione meccanica di altri nativo e progettato tessuti molli e idrogel morbido / materiali polimerici, ed è particolarmente utile quando il campo di deformazione superficiale del campione presenta eterogeneità significativa durante prove meccaniche.

Una storia ricca di ricerca che dura da oltre 50 anni, è stata focalizzata sulla quantificazione delle proprietà meccaniche dei tessuti vascolari. Questi studi ci permettono di capire meglio sia il comportamento fisiologico e patologico dei vasi sanguigni, forniscono una base per valutare l&#39;efficacia / compatibilità dei dispositivi endovascolari, e l&#39;aiuto nella progettazione e fabbricazione di vascolare ingegnerizzato costrutti 1-6. La misurazione accurata della risposta meccanica dei tessuti molli e la modellazione costitutiva delle loro caratteristiche meccaniche è intrinsecamente difficile a causa della meccanica eterogeneità anisotropia, e non linearità esibito dalla maggior parte dei tipi di tessuto. Inoltre, le misure sperimentali sono spesso confusi dalla complessità locale introdotto alle interfacce campione presa nel corso di prove meccaniche (cioè, la piegatura, l&#39;attrito, le concentrazioni di sollecitazione, lacrimazione) e l&#39;inevitabile passaggio di proprietà meccaniche volta tessuto viene asportato dal animale vivente. &lt;/ p&gt; Un esperimento trazione uniassiale è tra i più semplici prove meccaniche che possono essere eseguite su un campione costituito da un materiale solido, ed è spesso usato per valutare la risposta meccanica del tessuto vascolare. I risultati di questi esperimenti forniscono informazioni preliminari utili per entrambe le fonti tissutali native e artificiali, e possono essere utilizzati per confrontare gli effetti di alcuni trattamenti, stati di malattia, o composti farmacologici sul comportamento meccanico della parete vascolare 7-11. Monoassiale prove meccaniche dei tessuti molli viene in genere eseguito su campioni con geometrie relativamente omogenee, che sono più comunemente cane ossa o forma 7,8,12-14 anello. Tuttavia, allontanamento significativo da queste geometrie idealizzate può verificarsi a causa di sfide connesse con la dissezione dei tessuti, l&#39;isolamento, e di bloccaggio all&#39;interno del sistema di prova. Qualsiasi non uniformità nella geometria in ultima analisi, fonte di stress e tensione eterogeneicampi quando il campione è sottoposto ad estensione uniassiale, con il grado di eterogeneità dipende forma effettiva del campione, nonché le dimensioni del campione (rispetto alle impugnature) e le proprietà meccaniche del materiale 9,15,16. Quando eterogeneità di campo sono significativi, i calcoli di deformazione del campione sulla base delle posizioni di presa relative sono imprecise e quindi una base sufficiente per valutare il comportamento meccanico. Sistemi di analisi video sono stati ampiamente utilizzati per misure di deformazione dei tessuti molli, spesso utilizzando ad alto contrasto marcatori colorante applicato alla superficie del campione 17,18. Correlazione digitale delle immagini, una tecnica metrologico ottico che misura pieno campo di deformazione superficiale confrontando i valori di intensità di livello di grigio sulla superficie del campione prima e dopo la deformazione, è stato usato in combinazione con il video analisi dei tessuti molli 19-21. Ci sono diversi vantaggi di correlazione dell&#39;immagine digitale rispetto a interferometrMetodi ic che possono essere impiegati per le misurazioni. In primo luogo, come una tecnica di misurazione senza contatto, minimizza gli effetti confondenti di modificare le proprietà del materiale a causa del modo in cui il sistema di misurazione colpisce il campione. In secondo luogo, esso richiede un ambiente molto meno rigorose misura e che presenti una più ampia gamma di sensibilità e risoluzione rispetto ad altri metodi. Terzo, dotata della capacità di catturare un intero campo visivo, questa tecnica può caratterizzare sia la media e le risposte meccaniche locali. Per una spiegazione dettagliata del metodo, i lettori sono invitati a vedere il libro di Sutton 22. Per ottenere campi di deformazione sulla superficie del campione, una tecnica bidimensionale immagine correlazione digitale (2D-DIC) può essere utilizzato. In breve, le immagini del campione vengono acquisiti a stati caricati scaricati e vari. La prima immagine è suddivisa in piccoli quadrati chiamati sottoinsiemi (M × M pixel) che formano una rete per il successivo calcolo delCampi di deformazione 2D. La posizione di ogni quadrato nel campione deformato viene ottenuta utilizzando un algoritmo immagine corrispondente. Il movimento di ogni quadrato viene poi monitorato, immagine per immagine, ottenendo campi di spostamento che possono poi essere utilizzati per ricavare gradienti di deformazione e le tensioni attraverso una varietà di metodi, tra cui l&#39;interpolazione polinomiale elemento di raccordo o finiti. Nel presente manoscritto, mettiamo a disposizione una metodologia dettagliata per la valutazione dei campi di deformazione della superficie, sui tessuti vascolari autoctone attraverso l&#39;integrazione delle prove di trazione monoassiale e 2D-DIC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Uniaxial tensile mechanical tester</td>
			<td style="width:176px;">Enduratec</td>
			<td style="width:119px;">3230 AT/HR</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Blue tissue marking dye</td>
			<td style="width:176px;">http://www.ebay.com/itm/Tissue-Marking-Dye-in-Bottles-2oz-Bottle-1-ea-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&#38;hash=item2ed811f696</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sprayer</td>
			<td style="width:176px;">Anest-iwata</td>
			<td>CM-B</td>
			<td>Custom Micron B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera</td>
			<td style="width:176px;">Point Grey</td>
			<td style="width:119px;">GS2-GE-50S5M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lens</td>
			<td style="width:176px;">Tokina</td>
			<td style="width:119px;">AT-X M100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vascular tissue</td>
			<td style="width:176px;">Caughman Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.9% Sodium Chloride Injection PBS</td>
			<td style="width:176px;">BAXTER HEALTHCARE CORP.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vic_snap</td>
			<td style="width:176px;">Correlated Solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vic_2D</td>
			<td style="width:176px;">Correlated Solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wintest 4.1</td>
			<td style="width:176px;">Bose ElectroForce</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue adhesive</td>
			<td style="width:176px;">&#160;3M Vetbond&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disinfectant&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">04-355-13</td>
			<td>Decon BDD Bacdown Detergent Disinfectant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using digital image correlation to characterize local strains on vascular tissue specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

I dati meccanici acquisiti da una rampa di prova estensione monoassiale sul tessuto vascolare costituito da carico contro applicate rapporti di spostamento del campione ad un determinato tasso di spostamento. In questo studio, 2D-DIC in combinazione con test meccanici monoassiale viene utilizzato per misurare i campi di deformazione della superficie del campione in direzioni ortogonali in varie condizioni di deformi. La natura viscoelastica del tessuto vascolare si manifesta con la notevole grado di isteresi nelle curve di carico-spostamento prima di precondizionamento meccanica. Per promuovere la riproducibilità delle prove meccaniche e di ottenere una risposta elastica meccanica, il tessuto è condizionato mediante diversi cicli di carico-scarico in cui è progressivamente diminuita isteresi (Figura 1). Nonostante il estremamente accurata preparazione del campione e il montaggio, le misurazioni 2D-DIC dimostrano che il campo di deformazione della superficie dell&#39;intima ne risulta è molto eterogeneo sia nel<html> indicazioni circonferenziali e longitudinali. Come previsto, i valori di deformazione circonferenziale locali aumentano con spostamento campione applicata. Eterogeneità della configurazione strain circonferenziale dà generalmente valori inferiori vicino al centro del campione rispetto al vicino all&#39;interfaccia campione-grip, riflettendo gli effetti della presa sui ceppi locali (Figura 2). Nella direzione longitudinale, i risultanti ceppi compressione non uniforme sulla superficie del campione intimale aumentano il campione viene progressivamente esteso, e il campo di deformazione risultante esibisce un grado più pronunciato di eterogeneità rispetto alla direzione circonferenziale (figura 3). I coefficienti di variazione (CV) dei campi di deformazione della superficie in direzioni ortogonali sono stati calcolati per riflettere il grado di campo eterogeneità a Stati selezionare sperimentali, e sono stati trovati a diminuire monotonicamente con maggiore estensione del campione (Tabella 1). jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53625/53625fig1.jpg" /> Figura 1. precondizionamento Sperimentale di campione di tessuto vascolare per prove di trazione uniassiale. Un campione di forma rettangolare, è condizionato con tre cicli di carico-scarico per ottenere una risposta elastica riproducibile. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53625/53625fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53625/53625fig2.jpg" /> Figura 2. circonferenziale campo di deformazione all&#39;interno della zona del campione di interesse. (A) Esempio rappresentativo di maculato superficie del campione intimale e la zona individuata di interesse. (B) locale circonferenziale aa deformazione ε (%) all&#39;interno dell&#39;area individuata di interesse ad aumentarelivelli di sforzo applicato circonferenziale globale (passando da 1,6% al 9% al 18%, da sinistra a destra). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53625/53625fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53625/53625fig3.jpg" /> Figura 3. longitudinale campo di deformazione all&#39;interno della zona del campione di interesse. (A) Esempio rappresentativo di maculato superficie del campione intimale e la zona individuata di interesse. (B) locale longitudinale xx deformazione ε (%) all&#39;interno dell&#39;area individuata di interesse ad aumentare i livelli di applicare tensione circonferenziale globale (passando da 1,6% al 9% al 18%, da sinistra a destra). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53625/53625fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.</a> <tablefo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Strain circonferenziale globale [%] </td><td> CV in ε aa (%) </td><td> CV in ε xx (%) </td></tr><tr><td> 1.6 </td><td> 11.8 </td><td> 28.1 </td></tr><tr><td> 9.0 </td><td> 7.4 </td><td> 25.1 </td></tr><tr><td> 18.0 </td><td> 5.6 </td><td> 20.7 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Coefficienti di variazione dei campi di deformazione. Coefficienti di variazione (CV) di campi di deformazione superficie del campione intimali sia circonferenziale (ε aa) e longitudinale (ε xx) le direzioni a selezionare i livelli di tensione applicato circonferenziale globale.

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Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Utilizzo di Digital Image Correlation per caratterizzare ceppi locali vascolari campioni di tessuto

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

using-digital-image-correlation-to-characterize-local-strains-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K Views.  University of South Carolina. We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

Video: Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Ricerca

Biologia

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine ​​di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Microscopia confocale rivela l'aggregazione di recettore di superficie delle cellule tramite spettroscopia di correlazione di immagine

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

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Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Micron-scala Phenotyping tecniche di mais fasci vascolari basato su x-Ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of the intact endothelium will provide valuable information for understanding the cellular and molecular events in the dysfunctional endothelial cells. Here, we describe a modified en face immunofluorescence staining technique which enables scientists to obtain clear images of the intact endothelial surface and analyze the molecule expression patterns in situ. The method is simple and reliable for observing the entire endothelial monolayer at different sites of the aorta. This technique may be a promising tool for understanding the pathophysiology of atherosclerosis, especially at an early stage.

Here, we present a protocol for immunofluorescence staining to observe the endothelial cells of the mouse aorta directly. This technique is useful when studying the cellular and molecular phenotype of endothelial cells in different flow patterns and in the development of atherosclerosis.

Uso dell'immunofluorescenza en faccia per osservare direttamente le cellule endoteliali vascolari

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

Tessuto Adiposo Umano Microframmentazione per la Fenotipizzazione Cellulare e la Caratterizzazione del Secretome

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Divergenza del microbiota radicale in diversi habitat in base a reti di correlazione ponderate

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), and so on. To detect and analyze soluble or diffuse protein oligomers or aggregates, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can detect the diffusion speed and brightness of a single particle with a single molecule sensitivity, has been used. However, the proper procedure and know-how for protein aggregation detection have not been widely shared. Here, we show a standard procedure of FCS measurement for diffusion properties of aggregation-prone proteins in cell lysate and live cells: ALS-associated 25 kDa carboxyl-terminal fragment of TAR DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) and superoxide dismutase 1 (SOD1). The representative results show that a part of aggregates of green fluorescent protein (GFP)-tagged TDP25 was slightly included in the soluble fraction of murine neuroblastoma Neuro2a cell lysate. Moreover, GFP-tagged SOD1 carrying ALS-associated mutation shows a slower diffusion in live cells. Accordingly, we here introduce the procedure to detect the protein aggregation via its diffusion property using FCS.

We here introduce a procedure to measure protein oligomers and aggregation in cell lysate and live cells using fluorescence correlation spectroscopy.

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...