La maggior parte degli esperimenti studia le interazioni pianta-microbo concentrandosi sulla colonizzazione, ma il nostro protocollo è progettato per esaminare sia la colonizzazione che il mantenimento dei batteri sulla radice. Possiamo cambiare l'esperimento per adattarlo a diversi batteri e piante, e possiamo anche testare più batteri in ogni piastra da 24 pozzi. Per iniziare, utilizzare un perforatore a foro standard per creare dischi di rete di plastica.
Raccogliere i dischi in un contenitore di vetro e coprire liberamente. Sterilizzare utilizzando un'autoclave impostata su un ciclo secco di 20 minuti. Utilizzare pinzette sterilizzate a fiamma per distribuire circa 40 dischi di rete sterilizzati in un unico strato sulla superficie di una piastra di agar media di crescita delle piante precedentemente preparata.
Posizionare due semi precedentemente sterilizzati al centro di ogni rete. Sigillare il piatto con nastro chirurgico e incubare per due o sei giorni a quattro gradi Celsius nell'oscurità per vernalizzare i semi. Quindi, posizionare il lato agar piastra verso il basso in una camera di crescita delle piante per otto-10 giorni in impostazioni di breve giornata di nove ore di luce a 21 gradi Celsius e 15 ore di buio a 18 gradi Celsius per germinare e coltivare piantine.
Aggiungere un millilitro di mezzo di crescita batterica ad ogni pozzo di una piastra sterile da 24 pozzetto. Per trasferire le piantine germinate incorporate nella rete, utilizzare forcep sterilizzate a fiamma per sbucciare delicatamente la rete contenente due piantine germinate, di pari dimensioni e non danneggiate su e fuori dalla piastra di agar. Trasferire un galleggiante con piantine in ogni pozzo di liquido di crescita batterica, lato radice verso il basso.
Successivamente, i batteri resuspend sono cresciuti durante la notte su piastre di agar in mezzo di crescita batterico liquido. Aggiungere 10 microlitri di sospensione batterica ad ogni pozzo, ad eccezione dei pozzi di controllo solo per mezzo, per una concentrazione finale di un milione di unità di batteri che formano colonie per pozzo. Per sigillare la piastra per una crescita sterile, premere con cura la pellicola permeabile al gas sulla piastra senza toccare il lato appiccicoso.
Applicare la pressione intorno a ciascuno degli anelli realizzati dai pozzi per assicurarsi che ogni pozzo sia stato sigillato individualmente. Quindi, chiudere il piatto con il coperchio di plastica rannicchiato sul film permeabile al gas. Posizionare la piastra in una camera di crescita vegetale su uno shaker orbitale impostato su 220 giri/min e incubare per 18 ore nelle stesse condizioni in cui le piantine sono state originariamente germinate.
Per risciacquare tutti i galleggianti con le piante, aggiungere un millilitro di acqua sterile ad ogni pozzo di un nuovo piatto da 24 pozzetti. Rimuovere il film permeabile al gas dalla piastra con le piante e utilizzare forcep sterili per trasferire galleggianti in pozzi con acqua e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Quindi, riempire ogni pozzo di una nuova piastra da 24 pozzetti con un millilitro di mezzo di crescita vegetale.
Trasferire una rete in ogni pozzo e coprire con una guarnizione permeabile al gas. Incubare per 72 ore sullo shaker orbitale a 220 giri/min nella camera di crescita delle piante. Dopo l'incubazione, sciacquare le piante come fatto in precedenza.
Dopo il risciacquo, rimuovere le piantine dalla rete posizionando delicatamente le forcelle sterilizzate a fiamma sotto le foglie sul lato fogliare della rete. Pizzicare leggermente il gambo e muovere le piantine su e lontano dalla rete per spostare la radice senza romperla. Per rimuovere i batteri dalle radici delle piante, trasferire piantine da ogni rete in singoli pozzi di una piastra di sonicazione a 24 pozzetti contenente un millilitro di acqua doppia distillata.
Sonicare tutti i campioni all'interno della piastra contemporaneamente usando un sonicatore multipronged come descritto nel manoscritto. Per quantificare i batteri, eseguire diluizioni seriali 10 volte dei campioni sonicati nel mezzo di crescita batterico. Distribuire utilizzando perline di vetro sterili e incubare alla temperatura ottimale per i batteri fino a quando le singole colonie sono contabili.
Per raccogliere la radice vegetale intatta, utilizzare le forcep per rimuovere le piantine dalla rete. Quindi, trasferire ogni pianta su uno scivolo al microscopio posizionando la punta della radice sulla diapositiva e trascinandolo lontano dalla punta per impostare lo scarico dell'abbattura con la diapositiva, garantendo una radice raddrizzare per la migliore immagine. Aggiungere una goccia d'acqua o un mezzo sterile di crescita delle piante a ciascun campione per idratare le interfacce tra i copriscivolo e le diapositive.
Posizionare una coverlip di vetro appena sopra la corona della radice e sotto le foglie di germoglio per evitare l'inclinazione del coverslip e premere delicatamente verso il basso. Quindi, immagina i batteri usando filtri di eccitazione / emissione appropriati per differenziare i batteri l'uno dall'altro e dalla radice vegetale. Pseudomonas simiae, batterio naturalmente fluorescente, radici di arabidopsis thaliana colonizzate ed è stato mantenuto sulla radice dopo il trasferimento al mezzo di crescita delle piante.
La corona della radice, la lunghezza media e la punta mostrano fluorescenza a causa della colonizzazione delle Pseudomonas simiae. Il controllo negativo senza batteri non mostrò colonizzazione. Quando pseudomonas simiae sulle radici di arabidopsis thaliana sono state quantificate dopo 18 ore di colonizzazione o 72 ore di manutenzione, il numero totale di unità di formazione della colonia per piantina in entrambi i momenti ha mostrato una buona riproducibilità attraverso repliche biologiche eseguite in giorni diversi.
C'è stato un aumento del numero di unità di formazione della colonia per piantina dopo 72 ore nel mezzo di manutenzione, rispetto ai numeri osservati nel momento post-colonizzazione di 18 ore, indicando che la crescita attiva dei batteri colonizzati sulla radice della pianta si è verificata durante la fase di manutenzione. Tre specie di batteri isolati dalla thaliana arabidopsis coltivata in suolo naturale in condizioni di laboratorio sono state utilizzate per monitorare l'associazione di più specie sulle radici delle piante. Erano chiaramente differenziati su supporti contenenti X-gal a causa delle differenze nella morfologia e nel colore delle colonie, che permettevano di contare le unità di formazione della colonia per piantina di ogni specie senza selezione di antibiotici, anche nella cocultura multi-specie.
Queste tre specie di batteri sono state tutte colonizzate e mantenute sulla radice, da sole o in cocoltura batterica. Ogni specie ha mostrato tendenze simili in diverse repliche biologiche e tecniche, dimostrando che questo protocollo può essere utilizzato per misurare unità di formazione di colonie sia relative che totali per radice di ogni specie. Se coltivate da sole, nessuna singola specie ha mostrato un aumento sostanziale dell'abbondanza durante la fase di manutenzione, ma le unità generali di formazione delle colonie per radice della comunità combinata sono aumentate in coculture, indicando che questi batteri non vietano la colonizzazione degli altri ceppi.
I passaggi più difficili sono quelli che richiedono la rimozione di piante intatte dai dischi mesh. Essere pazienti e gentili lo renderà possibile. Se le cellule batteriche sono fluorescenti, i campioni potrebbero essere ordinati per citometria del flusso per determinare il numero relativo di cellule.
