La domanda chiave che vogliamo affrontare con questo metodo è come possiamo utilizzare campioni di RNA di materiale acquistato nei mercati alimentari locali per la clonazione di geni biotecnologicamente rilevanti? Qui, usiamo le ostriche del Pacifico come caso di studio per dimostrare questo approccio e potenziale ulteriore applicazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il sequenziamento convenzionale del genoma o del cDNA dei campioni di ostriche può essere aggirato.
Invece, le sequenze della subunità citocroma c ossidasi I e NADH deidrogenasi sono state confrontate con sequenze di riferimento pubblicamente disponibili dall'ostrica del Pacifico per selezionare l'esemplare più strettamente correlato. Il cDNA preparato da questo campione può essere utilizzato direttamente per la clonazione di geni biotecnologicamente rilevanti, che possono essere selezionati utilizzando le informazioni sulla sequenza pubblica. A dimostrare la procedura saranno Yongmei Lyu e Yuquan Li, due studenti laureati del Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center dell'Università Agraria di Nanchino.
Per preparare il campione di tessuto ostriche, utilizzare un bisturi sterilizzato per tagliare circa 100 milligrammi di tessuto molle omogeneo dal centro geometrico approssimativo di ogni esemplare di ostrica. Trasferire il campione in una malta riempita con 50 millilitri di azoto liquido. Macinare il tessuto di ostriche congelato in una polvere fine.
Pesare 75 milligrammi del tessuto congelato di ogni campione in un tubo di centrifuga sterile da 1,5 millilitri e mescolare con un millilitro di reagente di estrazione del tiocianato-fenolo di guanidinio. Il passaggio più critico di questa procedura è la fase di estrazione dell'RNA. Al fine di ridurre al minimo la degradazione dell'RNA, è essenziale ridurre il tempo tra la raccolta del tessuto ostriche e l'estrazione dell'RNA.
Centrifugare il campione a 14.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, aggiungere 200 microlitri di cloroformio e mescolare accuratamente su un miscelatore a vortice per 10-15 secondi fino a quando la miscela diventa bianco latteo. Quindi, centrifuga per 15 minuti come fatto in precedenza.
Con una pipetta da 200 microlitri, trasferire con cura lo strato acquoso superiore, senza disturbare l'interfase, in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di alcol isopropile nel tubo di centrifuga e invertire delicatamente per mescolare i campioni. Quindi lasciare i campioni sul ghiaccio per 20 minuti.
Centrifugare a 14.000 volte g e quattro gradi Celsius per otto minuti, e rimuovere il supernatante. Resostigliere il pellet in un millilitro di 75% di etanolo e centrifugare a 14.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere tutto il supernatante e ripetere il lavaggio in etanolo.
Asciugare i pellet per sei minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciogliere il pellet di RNA essiccato in 25 microlitri di acqua trattata con DEPC e tenere il tubo sul ghiaccio. Utilizzare i campioni di RNA entro 24 ore.
Per generare una libreria cDNA, preparare prima una miscela di reazione per ogni campione di RNA in un tubo PCR da 300 microliter aggiungendo soluzioni secondo il manoscritto. Aggiungere un microlitro del campione di RNA estratto nel tubo. Incubare la miscela in un termociclometro PCR per 60 minuti a 42 gradi Celsius, quindi aumentare la temperatura a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Archiviare la libreria cDNA generata per un massimo di 12 mesi a meno 20 gradi Celsius. In primo luogo, aggiungere un microliter della libreria cDNA generata ai tubi contenenti miscele PCR, preparati secondo il manoscritto. Posizionare i tubi PCR nel termociclometro PCR ed eseguire l'amplificazione PCR con una fase di denaturazione iniziale e 35 cicli di reazione PCR costituiti da un passo di ricottura, una fase di allungamento e una fase di denaturazione secondo il manoscritto.
Dopo i cicli, eseguire una fase di allungamento finalizzante per cinque minuti. Utilizzare cinque microlitri del prodotto PCR per verificare la qualità mediante elettroforesi a gel di agarosio. Osservate il gene AMPLIFICAto COX1 o ND come una singola banda rispettivamente a 759 o 748 coppie di basi.
Per purificare il resto del prodotto PCR, aggiungere 100 microlitri di tampone legante il DNA contenenti alte concentrazioni di sali chaotropici a ciascun campione. Vortice brevemente per mescolare il contenuto. Posizionare una colonna di purificazione in un tubo di centrifuga a due millilitri.
Pipettare la miscela di reazione nella colonna. Posizionare il tubo con la colonna montata in una centrifuga a 14.000 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il filtrato dal tubo di centrifuga a due millilitri, lavare due volte con 700 e 400 microlitri di soluzione di lavaggio W2 centrifugando a 14.000 volte g.
Quindi, riscaldare un millilitro di acqua deionizzata a 65 gradi Celsius in un riscaldatore a blocchi metallici. Trasferire la colonna in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e pipettare 25 microlitri dell'acqua deionizzata preriscaldata al centro della membrana della colonna bianca. Lasciare immergere la membrana per un minuto a temperatura ambiente.
Quindi, centrifugare il tubo con la colonna a 14.000 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Scartare la colonna e conservare il prodotto PCR purificato per un massimo di 12 mesi a meno 20 gradi Celsius. Opzionalmente, i primer inversi COX1 o ND possono essere utilizzati anche per il sequenziamento bidirezionale.
Per il sequenziamento Sanger, utilizzare il relativo primer in avanti COX1 o ND. Dopo aver recuperato i risultati del sequenziamento, confrontare le sequenze con la sequenza genomica del ceppo di riferimento delle ostriche del Pacifico utilizzando lo strumento online NCBI Nucleotide BLAST. Utilizzare i rispettivi primer avanti e indietro dei geni MgUGD e MgUXS per amplificare e purificare dalla PCR come fatto in precedenza.
Dopo aver incubato prodotti PCR purificati con tampone di digestione, preparare il vettore pET-30a predigerito sciogliendo 500 nanogrammi di pET-30a in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere acqua deionizzata per ricaricare fino a 16 microlitri. Quindi, aggiungere due microlitri di tampone di digestione 10 volte concentrato e un microliter ciascuno delle 20 unità di restrizione endonucleasi Nde1 e Xho1 nel tubo. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per tre ore.
Successivamente, aggiungere un microlitro di fosfatasi alcalina di un'unità e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora aggiuntiva. Quindi, posizionare il tubo in un riscaldatore a blocchi metallici preriscaldato a 75 gradi Celsius per 10 minuti per inattivare la fosfatasi alcalina. Dopo aver coltivato cellule E.coli BL21 con i geni MgUGD e MgUXS, trasferire la coltura in mezzo LB da 400 millilitri in un pallone tremante da due litri e posizionarla su uno shaker a 200 giri/min a una temperatura di 37 gradi Celsius.
Dopo tre ore, controllare la densità ottica su un fotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nanometri e assicurarsi che raggiunga un assorbimento di circa 0,5. Quindi ridurre la temperatura dello shaker a 20 gradi Celsius. Aggiungere 400 microlitri di IPTG un molare per indurre l'espressione delle proteine ricombinanti per tre ore.
Dopo aver raccolto le cellule, interrompere le cellule per sonicazione per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare a 14.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti e raccogliere il supernatante in un nuovo tubo per il test di attività. Dopo il test di attività, dissetare le reazioni aggiungendo 20 microlitri di metanolo e 40 microlitri di cloroformio alle miscele MgUXS e MgUGD.
Vortice le miscele campione, e centrifuga a 14.000 volte g per sei minuti e quattro gradi Celsius. Raccogliere lo strato acquoso superiore di ogni tubo in nuovi tubi per la spettrometria di massa MALDI-TOF. In questo esperimento, l'allineamento delle sequenze geniche COX1 e ND di un campione altamente divergente è stato confrontato con il ceppo di ostriche del Pacifico di riferimento.
Le frecce rosse mostrano differenze nucleotidiche tra la sequenza di riferimento e la sequenza dei campioni di cDNA ottenuti. Le sequenze dei geni COX1 e ND di un campione di ostriche strettamente correlato mostrano una bassa divergenza rispetto al ceppo di ostriche del Pacifico di riferimento. La spettrometria di massa MALDI-TOF mostra un'applicazione riuscita della libreria cDNA per clonare i geni rilevanti dal punto di vista industriale MgUGD e MgUXS.
L'immagine gel identifica anche l'acido UDP-glucuronico e l'UDP-xilosio generati dall'azione enzimatica dell'MgUGD e mgUXS successivamente espressi e purificati. Questo metodo non richiede una corrispondenza perfetta tra la sequenza di riferimento e le sequenze di marcatori ottenute e dovrebbe dare al ricercatore fiducia nel lavorare con ostriche senza riferimenti. In linea di principio, questo metodo può essere applicato a qualsiasi campione biologico senza riferimenti per il quale sono pubblicamente disponibili sequenze di una specie di riferimento strettamente correlata.
Questo metodo consente ai ricercatori non esperti di accedere facilmente a materiale genetico di potenziale importanza biologica e apre la strada a un maggior numero di scienziati per lavorare con campioni biologici facilmente accessibili ma identificati in modo incompleto.
