L'obiettivo chiave della biologia dello sviluppo è comprendere il ruolo specifico del contesto di un gene. E questo può essere difficile da raggiungere con mutanti knockout convenzionali o con linee di sovraespressione costitutive. Abbiamo utilizzato il sistema modulare di clonazione a cancello verde per generare una risorsa per l'espressione cito-specifica induttibile nei tre meristemi principali dell'impianto modello Arabidopsis thaliana.
Utilizzando la stessa strategia di clonazione modulare, questo metodo può essere applicato ad altre specie vegetali immutabili alla trasformazione. La dimostrazione visiva di questa procedura è preziosa perché l'analisi dell'effetto della transattivazione nei meristemi dello stelo e dell'apice corto richiede la dissezione prima dell'imaging, che può essere piuttosto impegnativo. Per iniziare, sterilizzare i semi come delineato nel protocollo di testo.
Quindi, preparare il mezzo di resistenza Murashige e Skoog a pH 5,8 e aggiungere l'uno per cento di saccarosio e lo 0,9% di agar. Dopo l'autoclave, aggiungere Dex sciolto in DMSO alle piastre di induzione ad una concentrazione finale compresa tra 10 e 30 micromolari. Aggiungere una quantità uguale di DMSO alle piastre di controllo.
Metti i semi per l'imaging delle radici sulle piastre e stratificali per 48 ore nell'oscurità e a quattro gradi Celsius. Metti le piastre in posizione verticale in un incubatore di piante e coltivale per cinque giorni. Cinque giorni dopo la germinazione, utilizzare la microscopia a scansione laser confocale per immagini le piantine.
Per iniziare, preparare e coltivare i semi come delineato nel protocollo di testo. Da sei a sette giorni dopo la germinazione, trasferire ogni piantina sul terreno in una pentola separata. Se si inducono le piante annaffiando, utilizzare una soluzione DEX da 25 micromolare in acqua, preparata da uno stock di 25 millimolare DEX sciolto in etanolo.
Annaffiare ogni due o tre giorni fino al tempo desiderato di induzione. Se si induce mediante immersione, preparare un bicchiere da un litro con 750 millilitri di acqua contenenti 0,02%Silwet L77 e DEX a concentrazione finale di 25 micromolare o una quantità equivalente di DMSO per il dex e il trattamento fittizio. Immergere una singola pianta nella soluzione di induzione o fittizia per 30 secondi.
Ripetere ogni due o tre giorni, fino al tempo desiderato per l'imaging. Per iniziare, preparare e coltivare i semi come delineato nel protocollo di testo. Da sei a sette giorni dopo la germinazione, trasferire ogni piantina sul terreno in una pentola separata.
Quando lo stelo è lungo circa un centimetro, spruzzare il MAS influorescente con una soluzione DEX tra 10 e 50 micromolare in acqua. Per l'induzione e l'imaging nelle fasi successive di sviluppo, indurre MAS di steli più lunghi o germogli laterali. Da 24 a 48 ore dopo l'induzione, sezionare i MAS e procedere all'imaging.
In primo luogo, trasferire le piantine dalla piastra a una soluzione di 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio e controsostenirle per cinque minuti. Posiziona le radici in una camera di imaging al microscopio e immaginile utilizzando un microscopio a scansione laser confocale con un obiettivo di immersione in acqua 63x. Per visualizzare la fluorescenza del ioduro propidio, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e raccogliere emissioni tra 590 e 660 nanometri.
Per la fluorescenza mTurquoise2, utilizzare l'eccitazione di 458 nanometri e raccogliere emissioni tra 460 e 615 nanometri utilizzando la scansione sequenziale. Per prima cosa, fissare uno stelo con un dito sul lato opposto della sezione desiderata. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare un segmento di circa tre centimetri ed eseguire diversi tagli fini.
Risciacquare la lama del rasoio in una piastra di Petri contenente acqua di rubinetto e raccogliere le sezioni del gambo. Macchiare le sezioni o montarle direttamente su vetrini al microscopio. Per la colorazione, preparare un millilitro di una soluzione di 250 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio in un tubo di reazione.
Rimuovere l'acqua del rubinetto dalla piastra di Petri con una pipetta e sostituirla con la soluzione di ioduro di propidio e macchiare per cinque minuti. Quindi, rimuovere la soluzione di ioduro di propidio e risciacquare con acqua. Utilizzando forcep fini o un pennello fine, trasferire le sezioni macchiate su vetrini al microscopio.
Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale con un obiettivo ad immersione in acqua 25x per immaginire i campioni. Utilizzare una luce laser di 561 nanometri per eccitare la fluorescenza dello ioduro propidio e raccogliere emissioni da 570 a 620 nanometri. Utilizzare una luce laser di 405 nanometri per eccitare l'effettore fluoroforo mTurquoise2 codificato dai costrutti della linea del driver e raccogliere emissioni da 425 a 475 nanometri.
Per prima cosa, usa le forcep per tagliare lo stelo di due centimetri sotto la punta del germoglio. Tenere il gambo in una mano e utilizzare forcep fini per rimuovere i boccioli di fiori e la grande primordia. Per rimuovere la giovane primordia, fissare il SAM in posizione verticale in una piastra di Petri contenente il tre per cento di agarosio.
Quindi, utilizzare un binocolo e le forceps per rimuovere qualsiasi giovane primordia vicino al MAS. Trasferire il MAS sezionato in un tubo contenente una soluzione di 250 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio. Lasciare macchiare il campione per cinque o 10 minuti assicurandosi che il campione rimanga completamente sommerso durante la procedura di colorazione.
Posizionare il MAS macchiato in una piccola piastra di Petri contenente il tre per cento di mezzo di agarosio. Coprire il MAS con acqua distillata doppia. Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale dotato di un obiettivo ad immersione in acqua di immersione 25x per l'immagine dei MAS sezionati.
Utilizzare una luce laser di 561 nanometri per eccitare la fluorescenza del ioduro propidio e raccogliere emissioni da 570 a 620 nanometri. Utilizzare una luce laser di 405 nanometri per eccitare il fluoroforo mTurquoise2 e raccogliere emissioni da 425 a 475 nanometri. Registra pile di immagini che si estendono per 50 micrometri nella direzione Z con una dimensione del passo di 0,5 micrometri.
L'induzione con DEX porta all'espressione mTurquoise2 specifica di tipo cellulare nell'endodermide della radice, nei precursori del phloem e nel cambium, e nelle cellule staminali nel meristem apicale shoot. Come test case per la trasattivazione, viene generata una linea di effettore che codifica il fattore di trascrizione master della parete cellulare secondaria VND7 fuso al dominio di attivazione V16. Dopo cinque giorni di trattamento singolo con 15 microlitri di DEX o DMSO, le sezioni staminali vengono preparate per la visualizzazione della lignificazione ectopica nella tona iniziale.
Le cellule di sheath iniziale nei campioni indotti mostrano un segnale forte per il canale di ioduro propidio e alcune cellule mostrano il tipico ispessimento reticolato della parete cellulare nelle cellule xilemiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come indurre l'espressione genica in diversi tessuti e come preparare i tuoi campioni per l'imaging. Seguendo questa procedura, le linee di guida stabilite possono essere utilizzate con un'ampia varietà di costrutti di effettori generati da altri utenti in base ai loro interessi di ricerca.
Questa scorciatoia dovrebbe aiutare i ricercatori delle piante a valutare rapidamente l'effetto dell'espressione specifica di tipo cellulare o della abbattimento di un gene di interesse in un modo riservato al tempo. Questo sistema di induzione specifico di tipo cellulare richiede l'uso del desametasone corticosteroideo. Il contatto diretto deve essere evitato, quindi è importante indossare guanti e una maschera facciale durante il trattamento.
