Qui presentiamo un semplice test di screening del nocciolo per analizzare la crescita di Aspergillus flavus e la produzione di aflatossina nei chicchi di mais che esprimono una proteina antimicotica. Utilizzando una proteina fluorescente verde che esprime il ceppo aspergillus flavus, monitoriamo l'infezione e la diffusione del fungo nei chicchi maturi in tempo reale. Questo semplice saggio fornisce un mezzo affidabile per valutare la capacità del chicco di mais di resistere all'infezione da Aspergillus flavus e alla produzione di aflatossina.
I risultati di questo saggio di laboratorio eseguito in condizioni controllate su kernel maturi sono ben correlati con i risultati dell'infezione in condizioni di campo. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Rajtilak Majumdar, un postdoc del nostro laboratorio, insieme a Christine Sickler e David Ambrosio, tecnici di scienze biologiche anche del nostro laboratorio. Per iniziare, incollare tappi a scatto da 20 due mm in una piastra di Petri per creare tappi KSA.
Lasciare asciugare la colla per 48 ore prima di usare i tappi. In un armadietto di sicurezza biologico spruzzare un vassoio quadrato di bioassay con 70% di etanolo in acqua. Lasciare asciugare l'aria del vassoio.
Aggiungere carta cromatografica sterile sul vassoio asciutto. Spruzzare nove dei tappi KSA con 70% di etanolo e lasciarli asciugare all'aria. Quindi posizionare i tappi sul vassoio del bioassay.
Per ogni linea di mais transgenico in fase di prova, selezionare 20 noccioli non danneggiati e metterli in un tubo di centrifuga da 50 ml. Utilizzando un microscopio stereo da tavolo selezionare solo kernel non danneggiati per il saggio. I chicchi danneggiati sono più suscettibili per l'attacco di Aspergillus e producono più aflatossina, intasando così i risultati e non rappresentando i veri tratti antimicotici o antimicrobici della varietà.
Aggiungere il 70% di etanolo a ciascun tubo. Lasciare sterilizzare i noccioli per quattro minuti mentre occasionalmente li scuotono delicatamente. Dopo questo versare delicatamente l'etanolo e sciacquare delicatamente i chicchi in acqua deionizzata sterile tre volte.
Ottieni una cultura di sei giorni di Aspergillus flavus macchia 70 esprimendo GFP coltivata su mezzo V8. Aggiungere 20 ml di sterile 0,02%Triton X-100 in acqua deionizzata. E usa un anello sterile per raschiare le spore.
Pipettare fuori dall'inoculo e trasferirlo in un becher sterile da 300 ml. Preparare una diluizione di cinque volte con 0,02%Triton X-100 e utilizzare un emocitometro per eseguire un conteggio delle spore. Diluire nuovamente se necessario per ottenere 100 ml con una concentrazione di quattro milioni di spore per ml.
Versare l'inoculo in un becher vuoto. Mettere i chicchi in un becher sterile da 300 ml con una barra di agitazione e mescolare per tre minuti. L'uso di forcep trasferisce i chicchi nella piastra di bioassay, assicurandosi di posizionare un solo kernel in ogni tappo.
Aggiungere 30 ml di acqua deionizzata sul fondo di ogni vassoio di dosaggio biologico. E incubare a 31 gradi Celsius per sette giorni. Dopo sette giorni di inoculazione con A.flavus, scatta foto di quattro chicchi che sono stati designati per l'analisi microscopica e la fotografia.
Quindi utilizzare un tessuto molle e acqua deionizzata per pulire l'esterno dei noccioli. Eseguire sezioni longitudinali di chicchi e scattare immediatamente fotografie al microscopio fluorescente. Per preparare i chicchi per l'analisi, pulire l'esterno dei noccioli rimanenti con un tessuto molle e acqua deionizzata.
Posizionare quattro noccioli, che costituiscono una rappresentazione, in una fiala in policarbonato a vite da 15 ml contenente due sfere di acciaio inossidabile. Congelare immediatamente le fiale in azoto liquido e conservare a 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per procedere con ulteriori lavorazioni e analisi. Quando è pronto, rimuovere i chicchi dal congelatore e utilizzare un omogeneizzatore per macinarli a 1500 giri/min per tre minuti.
Utilizzare gli stessi materiali macinati per l'analisi GFP, la determinazione dell'aflatossina e l'analisi molecolare, in modo che tutti i valori siano rappresentativi dei campioni. Mentre si consiglia un minimo di tre repliche, di più è sempre meglio a seconda della disponibilità di kernel di buona qualità. In questo studio gli embrioni immaturi delle linee HI-II del mais vengono trasformati utilizzando il ceppo Agrobacterium tumefaciens EHA101 contenente il vettore di destinazione finale della pianta che esprime il gene Lablab purpureus AILP sotto il controllo del promotore 35S dal virus del mosaico del cavolfiore.
L'amplificazione PCR del gene AILP bersaglio ha mostrato un amplicone di 548 bp osservato solo nelle linee di mais transgeniche. Il gene AILP ha mostrato espressione nelle linee transgeniche, mentre nessuna espressione AILP è stata osservata nelle piante di controllo. Le spore germinanti in fase iniziale sono esposte a estratti di foglie grezze da giovani piante di mais transgenico per 20 ore.
L'elevata lunghezza intera delle spore esposte agli estratti di foglie transgeniche mostra una riduzione dal 58 all'80% rispetto al controllo negativo. Il ceppo A.flavus utilizzato contiene un reporter GFP che consente il monitoraggio e la quantificazione della crescita fungina in tempo reale. Una significativa riduzione della fluorescenza GFP si osserva nei kernel AILP transgenici rispetto al controllo negativo isogenico.
Una riduzione significativa si vede nella crescita fungina per le linee AILP rispettivamente quattro e cinque, 69% e 72%. Le altre linee mostrano una riduzione dal 35 al 60% rispetto ai kernel di controllo. Una riduzione dal 62 all'88% del contenuto di aflatossina è stata osservata nei noccioli AILP rispetto al controllo.
La linea quattro ha il più basso contenuto di aflatossina a 486 ng per g, seguita da altre linee che avevano contenuti compresi tra 640 e 1498 ng per g nei noccioli. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi come l'uso di un fluorometro per quantificare la GFP e come sua crescita fungina. Kit commerciali immunobased o HPLC o EPLC possono essere utilizzati per eseguire la quantificazione dell'aflatossina.
La disponibilità di KSA fornisce un mezzo rapido e semplice per determinare la resistenza alla contaminazione da aflatossina. Le diverse linee di riproduzione del mais possono essere valutate rapidamente utilizzando questa tecnica. Sebbene il test di screening del nocciolo non sia pericoloso, l'operatore dovrebbe proteggersi dall'esposizione alle spore aspergillus flavus, utilizzare dispositivi di protezione adeguati.
