Questo protocollo consente ai ricercatori di generare virus pseudotipi che possono essere tranquillamente utilizzati per studiare eventi di ingresso virale di virus ad alta patogenicità, come il sal coronavirus e la maggior parte del coronavirus. Questa tecnica versatile si basa sulla facile configurazione della trasfezione transitoria. Questo sistema può anche essere applicato per produrre particelle pseudotipate con proteine di fusione di altri virus, non solo coronavirus S.Per ottenere i migliori risultati è importante monitorare la salute e la densità delle cellule per la trasfezione e per l'infezione da virus pseudotipo.
A dimostrare questa procedura saranno Tiffany Tang e Lakshmi Nathan. Studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare, lavare con cura le cellule HEK293T con 10 millilitri di 37 gradi Celsius, DPBS pre-riscaldato due volte.
Successivamente, aspirare il supernatante e attaccare le cellule con un millilitro di soluzione di tripsiderina del 25% che è stato preri riscaldato a 37 gradi Celsius. Inoltre, incubare il pallone delle cellule a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica del 5% per tre o cinque minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Aggiungere quattro millilitri di DMEM completo per disattivare la soluzione di tripina.
E poi contare le cellule usando una diapositiva di conteggio delle celle e un microscopio a luce. Diluire le cellule a 500.000 cellule per millilitro con DMEM completo. Successivamente, seminare due millilitri per pozzo della soluzione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetto.
E spostare delicatamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule. Dopo aver assicurato che le cellule siano distribuite uniformemente, incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di ambiente di anidride carbonica durante la notte o da 16 a 18 ore. Per preformare tre cotrasfezione plasmide, mescolare prima i volumi calcolati di plasmidi e il mezzo di coltura cellulare siere ridotto in un tubo di micro centrifuga.
Incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere tre microlitri per pozzo del reagente di trasfezione a base lipidica a 47 microlitri per pozzo del mezzo di coltura cellulare del siero ridotto. Incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti.
Successivamente, in un tubo di micro centrifuga, mescolare quantità uguali del reagente di trasfezione e le soluzioni plasmidici per tubo che si dirige su e giù più volte. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo l'incubazione notturna della piastra cellulare, utilizzare un microscopio a luce invertita per esaminare le cellule per la loro morfologia e densità.
Quindi, aspirare il mezzo speso di cellule e aggiungere delicatamente un millilitro per pozzo del mezzo di coltura cellulare ridotto preri riscaldato ad ogni pozzo. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di trasfezione a ciascun pozzo per quanto riguarda la caduta. E incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per quattro o sei ore.
Alla fine dell'incubazione, aggiungere un millilitro di DMEM di trasfezione libera da antibiotici preri warmed, a 37 gradi Celsius ad ogni pozzo. E incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 48 ore. Per iniziare la raccolta delle particelle pseudotipo utilizzare un microscopio a luce invertita per esamire le cellule per la loro morfologia e condizione generale.
Il colore del mezzo dovrebbe essere rosa chiaro o leggermente arancione. Quindi, trasferire i supernatanti delle cellule trasfette in tubi di centrifuga conica da 50 millilitri. Centrifugare i tubi a 290 volte la gravità per sette minuti per rimuovere i detriti cellulari.
Successivamente, il filtro ha chiarito il supernatante attraverso un filtro sterile di dimensioni dei pori da 0,45 micron. Creare aliquote di piccolo volume di pseudotipo di soluzione di virus in fiale criogeniche. E conservarli a -80 gradi Celsius.
Per eseguire l'infezione da particelle pseudotipate, prima cellule d'esame al microscopio leggero per confermare che esiste un tappeto confluente di cellule. Quindi, lavare le cellule tre volte con 0,5 millilitri del DPBS pre-riscaldato a 37 gradi Celsius. Successivamente, aspirare i supernatanti delle cellule e inoculare le cellule con 200 microlitri della soluzione di particelle pseudotipate scongelate.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per una o due ore. Dopo il periodo di incubazione, aggiungere 300 microlitri del DMEMc pre-riscaldato a 37 gradi Celsius. E incubare le cellule infette a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 72 ore.
Infine aspira i supernatanti delle cellule infette. E precedere il saggio del reporter luciferasi. Per quantificare l'infettività delle particelle pseudotipate prima scongelare il substrato di luciferina, conservato a meno 80 gradi Celsius, a cinque volte il tampone di lisi del saggio luciferasi conservato a meno 20 gradi Celsius a temperatura ambiente.
Quindi, diluire il tampone di lisi del saggio luciferasi a una volta la concentrazione con acqua sterile. Quindi, aggiungere 100 microlitri del tampone diluito a ciascun pozzo. E incubare a temperatura ambiente su un rocker per 15 minuti.
Per eseguire la misurazione dell'attività della luciferasi, un pozzo alla volta, aggiungere prima 20 microlitri di substrato di luciferina a un tubo di micro centrifuga. Quindi, aggiungere 10 microlitri del lisato al tubo. Mescolare il contenuto facendo scorrere delicatamente i tubi.
E ha posizionato il tubo in un dispositivo luminometrico. Chiudere il coperchio e misurare il valore di luminescenza del tubo. Registrare la misurazione relativa delle unità luminose e precedere l'analisi dei dati.
I test di infettività della SARS-Spp e del MERS-Spp nelle cellule ospiti sensibili, hanno mostrato una forte infettività media, rispetto alle particelle di controllo positive previste. Controlli non infetti e particelle di controllo negativo prive di glicoproteine virali avvolte. Anche i saggi di attività della luciferasi hanno mostrato una dipendenza da concentrazione dell'infettività SARS-Spp e MERS-Spp.
Un aumento dell'infettività SARS-Spp o MERS-Spp in cellule bersaglio scarsamente permissive, trasfettato per esprimere il recettore ACE2 di SARS-Spp, o recettore DPP4 di MERS-Spp, conferma che l'uso del recettore delle pseudovirne è simile a quello dei virus NATO per mediare l'attaccamento e l'ingresso di pseudovirioni. Ricontrollare i calcoli prima di eseguire questo passaggio. E assicurati che tutte le soluzioni siano mescolate bene durante il passaggio.
Un saggio western blot può essere eseguito su particelle pseudotipate concentrate per valutare l'incorporazione di glicoproteina S nelle pseudovirovie. Mentre le particelle pseudotipate qui descritte sono surrogati più sicuri dei virus nato, richiedono ancora precauzioni di livello due per la biosicurezza.
