NGF consegnato al cervello è impegnativo. Qui presentiamo un nuovo tipo di vettore che consente un rilascio sicuro e prolungato della proteina bioattiva. Questa tecnica consente un caricamento semplice ed efficiente di NGF in portatori di silicio porosi.
Viene effettuato a temperatura ambiente e senza utilizzare forti solventi organici. Poiché il design del portatore di silicio poroso è tonnibile, i vettori possono servire come impianti serbatoi NGF per un rilascio a lungo termine, ma possono anche essere modificati per trasportare altri fattori e farmaci. Per ingegneri e chimici, il processo di fabbricazione può essere più facile da eseguire.
Mentre per la vita scienziati e clinici, le procedure di coltura cellulare dovrebbero essere relativamente semplici da riprodurre. Inizia montando un wafer di silicio di un punto cinque per un punto cinque centimetri con una resistività ben caratterizzata in una cella di incisione di etamina politetrafluro usando una striscia di foglio di alluminio come contatto posteriore e un o-ring per sigillare la cella. Il tessuto è represisbile per l'uso di wafer di silicio con valori di resistività simili ogni volta.
Incidere elettrochimicamente il campione di silicio in una soluzione da tre a uno di acido fluoridrico akleus ed etanolo per 20 secondi ad una densità di corrente costante di 250 milliarti per centimetro al quadrato. Quindi sciacquare la superficie del film di silicio poroso risultante con etanolo tre volte prima di asciugarsi sotto un flusso di azoto. Quando il campione è asciutto, ossidare termicamente il campione di silicio poroso appena inciso nel forno a tubo a 800 gradi Celsius per un'ora nell'aria ambiente per formare un'impalcatura di silicio poroso ossidata.
Quando il campione si è raffreddato, utilizzare una sega di dicing per tagliarlo in un campione di otto per otto millimetri. Per caricare i campioni con NGF, erogare 52 microlitri di soluzione di carico NGF appena preparata sopra ogni campione e incubare i campioni per due ore a temperatura ambiente in un piatto coperto in condizioni di elevata umidità. Dopo due ore, raccogliere la soluzione sopra i campioni e diluire la soluzione di carico NGF e i campioni di soluzione di post carico raccolti nell'intervallo di concentrazione appropriato per il kit iliza.
Una volta diluiti tutti i campioni, aggiungere 100 microlitri dei campioni diluiti in campioni di curva di taratura a ciascun pozzo di un anticorpo di cattura NGF rivestito con piastra iliza a 96 pozzo per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare la piastra quattro volte e aggiungere cento microlitri di un microgrammo per millilitro di anticorpo di rilevamento biotentilato ad ogni pozzo per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente. Dopo quattro lavaggi, come dimostrato aggiungere 100 microlitri di Perossidasi Avidin-Rafano ad ogni pozzo per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente seguita da quattro lavaggi nel tampone di lavaggio come dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato ad ogni pozzo per un'incubazione di sviluppo del colore di 25 minuti a temperatura ambiente. Quindi utilizzare un lettore di micropiastrine per misurare l'assorbanza a 405 nanometri con la correzione della lunghezza d'onda impostata a 650 nanometri e determinare la concentrazione NGF sia nella soluzione di carico che nella soluzione di post carico raccolta in base alla curva di calibrazione. Per il rilascio in vitro di NGF, incubare i portatori di silicio poroso ossidato caricato NGF in due millilitri di zero punto zero un PBS molare integrato con l'uno per cento di albaman del siero di boyvina in zero punto zero due per cento di azide di sodio a 37 gradi Celsius e 100 rotazioni al minuto di adjatation orbitale.
Raccogliere la soluzione ogni due giorni sostituendola con due millilitri di PBS fresco dopo ogni aspirazione. Quindi congelare i campioni di rilascio raccolti in azoto liquido per meno 20 gradi Celsius di stoccaggio fino all'analisi NGF da parte di iliza come appena dimostrato. Per generare un feo cromo sitoma differenziato 12 o PC 12, la coltura cellulare, raccogliere la sospensione cellulare mediante sentrizzazione e sospendere le cellule in cinque millilitri di nuovo mezzo di crescita di base.
Dopo una seconda sentribugation, sospendere il palato in tre millilitri di mezzo di crescita di base e utilizzare una siringa calibro 23 per aspirare le cellule 10 volte a separare eventuali ammassi cellulari. Dopo il conteggio, seme uno per 10 alla quarta superficie di lavoro al quadrato per centimetro su una piastre rivestite di colligeno di tipo uno in presenza di mezzo di differenziazione. Posizionare le piastre nell'incubatrice.
Dopo 24 ore a 37 gradi Celsius aggiungere il portatore di silicio poroso fresco murino beta NGF o NGF caricato su ogni piastra e restituire le piastre all'incubatore. Per valutare la vitalità cellulare, incubare le colture con il 10% di un'appropriata soluzione di indicatore di vitalità in punti di tempo rappresentativi per cinque ore a 37 gradi Celsius e misurare l'assorbanza su uno spettrotropetometro a 490 nanometri con la correzione della lunghezza d'onda impostata a 630 nanometri. Per valutare la differenziazione cellulare pc 12 in presenza di portatori di silicio poroso caricati da NGF, seminare le cellule PC 12 in 12 piastre rivestite di collagene basso per 24 ore in un incubatore di coltura cellulare e introdurre i campioni rilasciati in vitro precedentemente ottenuti nei pozzi sperimentali appropriati.
Dopo un'incubazione di 24 ore, immagini le cellule tramite microscopia ottica e conta manualmente il numero di cellule con alkronurite in ogni pozzo. Per l'analisi morfometrica delle cellule pc 12 differenziate acquisire immagini di fase delle cellule coltivate fino a tre giorni dopo il trattamento con NGF e aprire i file nel neurone J.Convertire il file di immagine in un formato a otto bit e utilizzare la barra di scala dell'immagine per misurare il rapporto pixel/micrometro. Utilizzate analizzare e impostare la scala per impostare la scala e misurare la lunghezza di ogni neurite.
Quindi contare manualmente il numero di punti di diramazione e il numero di nouriti originati da ogni soma di cella. Vengono mostrate immagini di microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione della pellicola di silicio poroso ossidato risultante. Una micrografia top view del film rivela la sua natura altamente porosa con pori di circa 40 nanometri di diametro.
Una micrografia sezionale trasversale di un film scollato rivela uno spessore di strato poroso di due micrometri a nove punti caratterizzato da pori cilindrici interconnessi. Un rilascio prolungato di NGF senza effetto burst viene raggiunto per un periodo di un mese con un rilascio NGF più veloce durante la prima settimana rispetto a un tasso di rilascio molto più lento nei giorni successivi del periodo di rilascio. Il trattamento con portatori di silicio poroso carichi di NGF induce la formazione di neuriti in caratteristiche reti neuronali ramificate nelle colture cellulari PC 12.
Si noti che anche dopo 26 giorni, l'NGF rilasciato induce una differenziazione cellulare superiore al 50% indicando che l'intrappolamento NGF all'interno dell'ospite poroso preserva l'attività biologica della proteina per un periodo di circa un mese. L'analisi morfometrica delle popolazioni di cellule porose trattate con silicio caricato da NGF nei giorni uno e tre rivela che le cellule PC 12 trattate con silicio poroso caricato con NGF presentano valori morfometrici simili a quelli osservati nelle colture di trattamento controllato per tutti e tre i parametri testati. Seguire e soddisfare adeguatamente i passaggi presentati ti fornirà un vantaggioso sistema di erogazione NGF in grado di sostenere la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule neuronali.
Attualmente stiamo studiando l'uso di portatori di silicio poroso NGF come impianti di rilascio a lungo termine nel cervello per studiarne il normale effetto protettivo e conoscere malattie degenerative come il morbo di Alzheimer. A seguito di questa procedura, è anche possibile studiare l'effetto dei portatori di silicio poroso caricato da NGF su una normale crescita delle cellule di cancrena in legno dosale. Il silicio poroso è un nano materiale promettente che può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni.
Diverso da quello qui presentato, inclusi sensori biologici o chimici, diagnostica e imaging. Per escludere qualsiasi potenziale tossicità dei portatori di silicio poroso, verso la linea cellulare, assicurati di eseguire un saggio di separabilità e sterilizzare i tuoi campioni di silicio poroso.
