L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un metodo per valutare l'attività endogena della LRRK2 chinasi nel sangue periferico umano. Ciò si ottiene monitorando la fosforilazione mediata da LRRK2 delle proteine rab, impiegando anticorpi monoclonali Rab specifici della Michael J.Fox Foundation. Qui, ci concentriamo sui neutrofili del sangue periferico umano come costituiti da popolazione omogenea del sito con alti livelli di espressione sia di Rab2 che di Rab10.
L'isolamento neutrofilo si basa su una selezione negativa che entro 40 minuti dall'azione finita consente l'isolamento di neutrofili puri e vitali al 99% producendo allo stesso tempo un'elevata quantità di livelli proteici. Raccogliere 10 millilitri di sangue in un tubo di raccolta del sangue. Mescolare delicatamente invertendo i tubi da sette a otto volte.
Trasferire 10 millilitri di sangue in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere al sangue 100 microlitri di soluzione stock EDTA 1, 0.1 molare EDTA PBS Soluzione, mescolare delicatamente. Aggiungere 500 microlitri di isolamento cocktail, 50 microlitri per millilitro dal kit di isolamento neutrofilo al campione di sangue intero.
Vortice le perline magnetiche dal kit di isolamento neutrofilo per 30 secondi prima dell'uso al fine di rimodere perline magnetiche molto fini. Aggiungere 500 microlitri perline magnetiche al campione di sangue e mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Ricaricare il tubo fino a 50 millilitri con soluzione stock EDTA 2. Questa è una soluzione PBS EDTA millimolare. Mescolare con molto delicatamente pipettando su e giù da due a tre volte.
Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare la successiva agitazione del tubo. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Sospensione cellulare arricchita con pipetta con cura che contiene neutrofili in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.
Non toccare il lato del tubo a contatto con il magnete ed evitare la raccolta e la perturbazione dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Lasciare circa 10 millilitri della sospensione dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Perline magnetiche vortice per 30 secondi prima dell'uso e aggiungere perline magnetiche da 0,5 millilitri al tubo contenente i neutrofili arricchiti.
Mescolare delicatamente invertendo il tubo. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare la successiva agitazione.
Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita che contiene neutrofili in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Non toccare il lato del tubo a contatto con il magnete.
Lasciare circa cinque millilitri della sospensione nella parte inferiore del tubo. Per garantire la completa rimozione delle perline magnetiche dalla miscela cellulare, posizionare il tubo contenente celle arricchite nel magnete. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita che ora contiene neutrofili puri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Non toccare il lato del tubo a contatto con il magnete. Lasciare circa cinque millilitri di sospensione nella parte inferiore del tubo.
Ricaricare le cellule isolate con una soluzione di stock di EDTA millimolare da 2 a un volume finale di circa 41 millilitri. Pipetta su e giù per mescolare. Dividere la soluzione equamente in due tubi con circa 20 millilitri in ogni tubo.
Centrifuga entrambi i tubi a 335G per cinque minuti. Durante la fase di centrifugazione, prendere lo stock di inibitore MLi-2, 200 micromolare tagliare la concentrazione 1000X dal congelatore meno 80 gradi e lasciare a temperatura ambiente per l'uso successivo. Subito dopo la fase di centrifugazione e senza agitazione dei tubi, versare il supernatante senza disturbare i pellet neutrofili.
rimospendare ogni pellet cellulare in 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare a temperatura ambiente tubazionando delicatamente le cellule su e giù quattro volte. Etichettare un tubo DMSO e l'altro tubo MLi-2. Al tubo etichettato DMSO aggiungere 10 microlitri di DMSO e aggiungere 10 microlitri di soluzione stock MLi-2 micromolare con pipettando delicatamente su e giù per mescolare.
Incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente per inversione ogni 10 minuti durante il periodo di incubazione. Durante il trattamento inibitore della chinasi LRRK2 di 30 minuti rimuovere la soluzione di stock di DIFP molare 0,5 dal congelatore meno 80 gradi e posizionare nella cappa dei fumi sul ghiaccio.
Quindi, spostare un milligrammo per millilitro Microcystin-LR soluzione di magazzino dal congelatore meno 80 gradi e posizionarlo a temperatura ambiente per scongelare. Scongelare un'aliquota, 0,25 millilitro del tampone di lisi togliendola dal congelatore, lasciare scongelare a temperatura ambiente e quindi posizionare sul ghiaccio per un uso successivo. Preparare un millilitro di supporto RPMI contenente un microliter di DMSO chiamare questo dmso resuspension buffer.
Preparare un millilitro di mezzo RPMI contenente un microlitro di MLi-2 micromolare o inibitore alternativo della chinasi LRRK2 e chiamare questo buffer di resuspensione MLi-2. Dopo il periodo di incubazione di 30 minuti, centrifuga entrambi i tubi a 335G per cinque minuti, come prima. Scartare con cura il supernatante in ogni tubo senza disturbare il pellet neutrofilo.
Per il tubo etichettato DMSO, rimorsi delicatamente pellet in un millilitro di DMSO Resuspension Buffer. E per il tubo etichettato MLi-2, resuspend pellet in un millilitro di MLi-2 Resuspension Buffer. Trasferire pellet di cellule rimorsi a corrispondenti tubi di centrifugazione etichettati DMSO e MLi-2 e centrifugare entrambi i tubi a 335G per tre minuti.
Durante la fase di centrifugazione, preparare il tampone di lysis. Nella cappa aspirante aggiungere con cura 0,25 microlitri di soluzione DIFP molare da 0,5, nonché 0,25 microlitri di un milligrammo per microcistina-LR millilitro al tampone di lisi da 0,25 millilitri. Mescolare e lasciare sul ghiaccio fino all'uso.
Subito dopo la centrifugazione, rimuovere con cura e completamente tutto il supernatante con una pipetta senza disturbare il pellet neutrofilo e posizionare i tubi sul ghiaccio. Aggiungere immediatamente 100 microlitri di tampone di lisi contenenti DIFP e microcistina-LR a ciascun tubo. Utilizzando una pipetta da 100 a 200 microliter, rimorsi il pellet di cella tubazione su e giù da cinque a 10 volte.
Giacere le cellule sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, centrifuga i tubi a 20.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi celsius per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il supernatante DMSO e MLi-2 contenente lisati neutrofili in nuovi tubi di centrifugazione.
Scartare i pellet di detriti. I lisati neutrofili sono ora pronti per l'uso o possono essere congelati a secco liquido e conservati a meno 80 gradi per l'analisi futura. Utilizzando i dati del database delle importazioni pubblicamente disponibile, questo grafico mostra che l'abbondanza delle proteine LRRK2 e Rab10 è particolarmente alta nei neutrofili e nei monociti del sangue periferico umano.
Isolare i neutrofili del sangue periferico umano con questa procedura si traduce in un'elevata resa impura delle cellule. La tabella in alto mostra il numero totale di cellule isolate da 10 millilitri di sangue periferico da tre donatori sani. Sono inoltre mostrate la purezza e la vitalità delle cellule isolate, così come la resa totale di glisato proteico.
Dopo il trattamento con e senza l'inibitore della chinasi LRRK2, MLi-2, i neutrofili vengono lisciviati in presenza del potente inibitore della proteasi, DIFP. Per la figura B sul lato sinistro, 10 microgrammi di estratti interi di cellule per corsia sono stati sottoposti ad analisi immunoblot quantitativo multiplex con gli anticorpi indicati. La figura a destra, C, dimostra l'importanza della DIFP per la prevenzione della degradazione proteolitica, in particolare della grande proteina LRRK2.
In confronto, le alte concentrazioni di PMSF da sole sono meno efficaci. Qui viene mostrato che la fosforilazione Rab10 controllata da LRRK2 è significativamente aumentata di circa tre volte nei neutrofili del sangue periferici derivati da pazienti con morbo ereditario di Parkinson che ospitano una mutazione VPS35 D620N eterozigote rispetto ai controlli. Il grafico superiore mostra l'analisi dell'immunoblot multiplex e il fondo, la sua quantificazione.
Ciò suggerisce che la mutazione VPS35 D620N attivi il percorso di attività della chinasi LRRK2 con un meccanismo ancora sconosciuto. In sintesi, presentiamo un saggio facile e robusto per misurare l'attività della via della chinasi LRRK2 monitorando la fosforilazione della proteina Rab, come Rab10, nei neutrofili di derivazione periferica umana, questo metodo ci consente di valutare l'attività della via LRRK2 e determinare come mutazioni, stati di malattia o inibitori modulano l'attività del percorso LRRK2.
