Questo protocollo ha riportato la trasformazione delle nanofibremembrane elettrospunte tradizionali dal 2D al 3D, attraverso la depressurizzazione del fluido di CO2 subcritico che non è stato realizzato in precedenza. Questo metodo elimina molti problemi associati ad approcci precedenti, tra cui l'uso di soluzioni acquose e reazioni chimiche, processi a più passaggi, perdita di attività di molecole biologiche incapsulate e limitazioni dei polimeri idrofobi. A dimostrare questa procedura è Shixuan Chen, un postdoc del mio laboratorio.
In un tubo di vetro da 20 mililitre, sciogliere due grammi di PCL in una miscela solvente di diclorometano e DMF, con un rapporto quattro a uno ad una concentrazione del 10%. Posizionare il tubo di vetro in un rotatore da laboratorio fino a quando la soluzione non diventa chiara. La soluzione può mescolarsi durante la notte.
Per impostare l'apparato elettrofilante, aggiungere innanzitutto la soluzione PCL a una siringa da 20 millilitri con un ago smussato calibro 21 collegato. Assicurarsi che non ci sia aria nella siringa e tubi dissociati. Posizionare un tamburo in acciaio rotante con il collettore di terra a 12 centimetri dalla punta dell'ago.
Utilizzando clip di alligatore, collegare l'alimentatore ad alta tensione a corrente diretta all'ago e assicurarsi che il collettore sia a terra. Per i 20 millilitri della soluzione PCL, impostare il parametro della pompa siringa utilizzando un diametro di 20,27 millimetri e una portata di 0,5 millilitri all'ora. Controllare se le goccioline si stanno formando sulla punta dell'ago.
Applicare un potenziale elettrico di 20 kilovolt tra lo spinneret e un collettore di terra situato a 20 centimetri di distanza dallo spinneret. Raccogliere i tappetini in nanofibra allineati in un tamburo, ruotando a 2.000 giri/min. Raccogliere i tappetini in nanofibra PCL una volta raggiunto uno spessore di circa un millimetro.
Immergere i tappetini in nanofibra PCL in azoto liquido per cinque minuti. Mantenere i tappetini in nanofibra PCL in azoto liquido e punzonare i tappetini in nanofibra PCL con un punzone di 0,5 millimetri di diametro. Posizionare i tappetini in nanofibra PCL in azoto liquido per cinque minuti.
Tagliare i tappetini in quadrati di un centimetro per un centimetro usando forbici chirurgiche affilate mentre sono immersi nell'azoto liquido per evitare la deformazione dei bordi. Posizionare il tappetino tagliato in un tubo di centrifuga da 30 millilitri con circa un grammo di ghiaccio secco. Limitare saldamente il coperchio e consentire al ghiaccio secco di passare all'anidride carbonica liquida.
Una volta che il liquido si è formato nel tubo, rilasciare rapidamente la pressione aprendo il tappo. Rimuovere e osservare l'impalcatura gonfia dal tubo. Posizionare l'impalcatura in un nuovo tubo di centrifuga con ghiaccio secco e ripetere l'utilizzo dello spessore del desiderio.
Sterilizzare le impalcature espanse in nanofibra in ossido di etilene prima dell'incubazione con le cellule. L'efficacia dell'espansione dei tradizionali tappetini in nanofibra elettrospun 2D in impalcature 3D attraverso la depressurizzazione del fluido di CO2 subcritico viene mostrata a sinistra dopo il secondo trattamento. Lo spessore dell'impalcatura è aumentato da un millimetro quando non trattato a 2,5 millimetri con un trattamento di CO2, a 19,2 millimetri con due trattamenti di CO2.
La porosità delle impalcature è aumentata dal 79,5% per i tappetini non trattati, al 92,1% dopo il primo trattamento, al 99,0% dopo il secondo trattamento. Questo è significativo perché il grado di penetrazione cellulare in un'impalcatura, e quindi la sua efficacia per indurre la rigenerazione, dipende in gran parte dalla porosità. Le immagini SEM rivelano che la struttura fibulare densamente imballata di tappetini 2D non trattati è stata trasformata in strutture ordinate e stratificate con nano fibre allineate dopo l'espansione con CO2.
In Vevo gli studi sono stati effettuati mediante impianto sottocutaneo di impalcature in nanofis fibre espanse di CO2 con fori a matrice quadrata ai ratti. Ciò consente la migrazione cellulare e la proliferazione all'interno dei fori, così come ulteriori infiltrazioni all'interno degli strati di nano fiber che sono stati creati durante l'espansione. Dalla prima alla quarta settimana dopo l'impianto, le impalcature espanse hanno mostrato un aumento significativo del numero di vasi sanguigni formati e cellule giganti multinucleate rispetto a un tradizionale tappetino a nano fiber.
Seguendo questa procedura, diverse molecole tra cui fattori di crescita, composti amminomodulanti, agenti emostatici e agenti anti-microtubulari possono essere incorporate nei tappetini nano fiber e espanse in fluido di CO2 subcritico. Tali impalcature a nanofia fibra espansa funzionalizzate potrebbero essere utilizzate per esplorare nuove domande in altri campi scientifici, come l'emostasi, la prevenzione e il trattamento delle infezioni, l'immunologia e la rigenerazione e riparazione dei tessuti. I solventi organici sono tossici e devono essere maneggiati in una cappa chimica.
Inoltre, un contenitore che può sopportare l'alta pressione del fluido di CO2 subcritico dovrebbe essere utilizzato per l'espansione.
