L'obiettivo generale di questa procedura è valutare in vitro l'impatto degli agenti di inversione della latenza sull'elaborazione dell'mRNA hiv. Il protocollo fornisce un metodo semplice ed efficiente e affidabile per valutare, contemporaneamente, l'effetto dell'LRA sulla trascrizione e lo splicing dell'HIV. Questa tecnica ha fornito una visione della capacità degli LRI di indurre la riattivazione e la clearance dei virus del serbatoio latente.
Dopo aver coltivato le cellule, posizionarne 20.000 in 100 microlitri di mezzo DMEM, integrati con 10%FBS e senza antibiotici nei pozzi di una piastra inferiore piatta da 96 po 'per 24 ore. Il giorno dopo diluire il costrutto di reporter a doppio colore. Tat e Rev DNA in 50 microlitri di mezzo privo di siero e mescolare delicatamente.
Mescolare delicatamente il reagente lipidico, quindi diluire 0,65 microlitri di esso per reazione in 50 microlitri di mezzo privo di siero. Mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Unire il reagente lipidico diluito con il DNA diluito e mescolare delicatamente.
Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi, erogare 100 microlitri di questo complesso di DNA reagente lipidico per quanto riguarda la caduta, sopra le cellule di ogni pozzo. Scuotere delicatamente il piatto avanti e indietro per mescolare.
E incubare la piastra in un incubatore umidificato, a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica per cinque ore. Successivamente, trasfetto pozzi aggiuntivi con 100 nanogrammi di EGFP guidato da CMV e DsRed esprimono plasmide di DNA a scopo di compensazione. Per iniziare, diluire ogni agente di inversione della latenza alla condizione di lavoro appropriata con il mezzo di crescita.
Utilizzando una testa di tubo multicanale, aspirare attentamente il mezzo di trasfezione e sostituirlo con 100 microlitri di mezzo contenenti l'agente di retromarco della latenza appropriato. Incubare in un incubatore umidificato al 37% celsius con 5% di anidride carbonica per 48 ore. Per iniziare a macchiare le celle, utilizzare una testa di tubo multicanale per aggiungere 100 microlitri di PBS a ciascun pozzo.
Tubo delicatamente testa su e giù circa cinque volte. Assicurandosi di evitare di schiumare per staccare le cellule nel supporto. Successivamente, trasferire le cellule nei pozzi di una piastra inferiore a V da 96 po '.
Centrifuga a 500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il mezzo e pbs senza toccare le cellule. Lavare le cellule almeno una volta con 200 microlitri di proteine e PBS senza siero.
Centrifuga a 500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Inclinare la piastra per scartare il supernatante e rimuovere il tampone di lavaggio senza toccare le cellule. Dopo questo diluire il colorante di vitalità fissa in PBS privo di proteine e siero con un rapporto da 1 a 1000, per preparare una soluzione di lavoro.
Aggiungere 50 microlitri del colorante diluito ad ogni pozzo e testa del tubo su e giù per mescolare. Incubare a quattro gradi Celsius. Mentre è protetto dalla luce usando un foglio per 10-15 minuti.
Quindi lavare le cellule una o due volte con 150 microlitri di tampone di lavaggio. Dopo di ciò, centrifugare a 500 volte la gravità, e quattro gradi Celsius per cinque minuti, e scartare il supernatante. Per fissare le cellule, aggiungere 100 microlitri di formaldeide e tampone di lavaggio preparati al momento all'1%.
E incubare a quattro gradi celsius mentre è protetto dalla luce per 10-15 minuti. Dopo questo, lavare le cellule una o due volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio. Centrifuga a 500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 70 microlitri di tampone di lavaggio. Dopo aver controllato le prestazioni e la sensibilità delle impostazioni del citometro eseguendo perline di calibrazione, regolare le tensioni di dispersione avanti e laterale con campione non macchiato, in modo che la popolazione principale sia sullo schermo e chiaramente percepibile. Eseguire la compensazione manuale o automatica utilizzando i singoli campioni macchiati, garantendo una minima fuoriuscita di popolazione positiva EGFP nel rilevatore DsRed e viceversa.
Utilizzando la fluorescenza meno un controllo, create grafici e impostate i cancelli. Quindi, regolare le tensioni di dispersione avanti e laterale con campione non macchiato, in modo che la popolazione principale sia sullo schermo e chiaramente percepibile. Acquisire e registrare almeno 10.000 eventi cella validi per campione.
Successivamente, utilizzare il software di analisi dei dati della citometria del flusso per analizzare i dati come descritto nel protocollo di testo. Risultati rappresentativi per l'espressione di HIV-1, prodotti non sfegati e spliced, dopo il trattamento con l'inibitore del bromodominio JQ1, mostrano che sia JQ1 positivo che Tat, aumentano significativamente la percentuale di cellule che esprimono EGFP. Il che è indicativo di trascrizioni non diffuse.
JQ1 positivo è anche visto per aumentare significativamente la percentuale di cellule che esprimono DsRed. E aumentare la proporzione di prodotto spliced a livelli simili a Tat. Ciò conferma la capacità di JQ1 positivo di attivare la trascrizione e lo splicing dell'HIV.
Tuttavia, il trattamento con un controllo stereoisomero JQ1 negativo, abolisce l'effetto positivo JQ1 sulla trascrizione e lo splicing dell'HIV. Una volta padroneggiato, questo metodo può essere eseguito usando farmaci individualmente o in combinazione. Test per la loro capacità di sinergizzare in modo efficiente.
Il che porterebbe a una dose inferiore del farmaco e alla tossicità. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada al test di combinazioni efficienti di farmaci in modelli primari di latenza in campioni di pazienti ex vivo.
