Grazie alla sua elevata efficienza, questo metodo può far progredire ulteriormente le cellule staminali pluripotenti indotte, o IPSC come strumento per studiare le malattie umane e sviluppare nuove terapie con cellule staminali. Il principale vantaggio di questo protocollo è la capacità di generare IPSC senza integrazione di alta qualità da fibroblasti umani primari tra cui fibroblasti umani difficili da riprogrammare, associati a malattie, invecchiati e senescenti. Il successo di questo metodo dipende dall'efficienza ottimale della trasfezione dell'RNA dei fibroblasti.
E regolare il pH di un buffer di trasfezione è una procedura chiave per raggiungere questo obiettivo. Per iniziare, preparare il tampone di trasfezione utilizzando 500 millilitri e 100 millilitri bottiglie pre-riscaldate a temperatura ambiente di mezzo siero fresco ridotto. Misurare il pH di base del mezzo in bottiglia da 500 millilitri inserendo l'elettrodo di vetro del pH meter nel tampone e attendere fino a un minuto prima di leggere il pH.
Per regolare il pH, aggiungere da tre a quattro millilitri di un idrossido di sodio molare in una bottiglia da 500 millilitri. Chiudere la bottiglia e mescolare bene. Dopo aver atteso cinque minuti, aprire il flacone e inserire l'elettrodo del misuratore di pH nel tampone.
Attendere che la lettura sul pH meter si stabilizzi. Continuare ad aggiungere piccoli volumi di un idrossido di sodio molare fino a quando il pH raggiunge 8,15 a 8,17, assicurandosi di calibrare il misuratore di pH più volte durante il processo. Utilizzare un sistema di filtrazione sottovuoto da 0,22 micrometri per filtrare la sterilizzazione del tampone di trasfezione.
Aliquotare il tampone sterilizzato in cinque tubi millilitro con uno spazio d'aria minimo. Verificare che i fibroblasti da riprogrammare siano confluenza dal 40% al 60%. Trasferire quattro millilitri di DPBS in un tubo conico da 15 millilitri e aggiungere 100 microlitri di laminina umana ricombinante 521.
Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Aggiungere un millilitro per pozzo di laminina umana ricombinante diluita 521 in tre pozzi di una piastra a sei pozzetti. Incubare questa piastra rivestita a 37 gradi Celsius per due ore.
Durante questa incubazione, caldi sei millilitri di mezzo di espansione dei fibroblasti e quattro millilitri di mezzo placcatura a 37 gradi celsius. Integrare il mezzo di placcatura con FGF di base ad una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro e B18R ad una concentrazione finale di 200 nanogrammi per millilitro. Aspirare con cura il mezzo speso da fibroblasti che sono dal 40% al 60% di confluenza.
Risciacquare le cellule con cinque millilitri di DPBS. Aggiungere tre millilitri di TRIPRINA EDTA e scuotere delicatamente la piastra per coprire le cellule con tripside EDTA. Aspirare il liquido in eccesso, lasciando circa 500 microlitri di tripparina, e incubare i fibroblasti per tre minuti a 37 gradi celsius.
Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, toccare saldamente ma con attenzione il lato della piastra per rimuovere le cellule. Visualizzare le celle al microscopio per verificare se sono state staccate. Aggiungere cinque millilitri di mezzo di espansione dei fibroblasti alle cellule staccate per neutralizzare l'EDTA della tripparina.
Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e mescolarle bene. Contare le cellule usando un emocitometro, quindi pipettare 12.000 cellule in quattro millilitri di mezzo di placcatura pre-riscaldato precedentemente preparato. Dopo aver rimosso la piastra rivestita dall'incubatore, aspirare la laminina diluita 521 dai pozzi, assicurandosi che la superficie dei pozzi non si asciughi.
Rimospendare delicatamente le cellule che si trovano nel mezzo di placcatura e aggiungere un millilitro di sospensione cellulare in ogni pozzo rivestito. Posizionare le celle placcate in un incubatore di coltura di tessuti tri-gas con basso ossigeno o ossigeno impostato al 5%E quindi disperdere delicatamente ma accuratamente le cellule alternando un movimento verso l'alto verso il basso, quindi a sinistra destra, e ripetere i movimenti altre due volte, assicurandosi di non ruotare la piastra. Incubare le cellule durante la notte.
Nel frattempo, aggiungere quattro millilitri di mezzo di riprogrammazione a un tubo conico da 15 millilitri e posizionarlo nell'incubatore basso O due con un tappo allentato per equilibrare durante la notte. Almeno un'ora prima della trasfezione, rimuovere il mezzo di riprogrammazione equilibrato da un incubatore basso O due. Aggiungere bFGF a una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro, e B18R ad una concentrazione finale di 200 nanogrammi per millilitro, e mescolare bene.
Lavorando un bene alla volta, utilizzare una pipetta millilitro per rimuovere il mezzo speso. E sostituirlo con un millilitro di mezzo di riprogrammazione, integrato con bFGF e B18R. Spostare la piastra con le cellule nell'incubatrice a basso ossigeno.
Per iniziare la trasfezione dei fibroblasti, equilibrare prima un'aliquota del tampone di trasfezione per circa un'ora a temperatura ambiente. Rimuovere una singola aliquota di 33 microliter di MRNA modificati e un'aliquota di 14 microliter di MIRNA imita da -80 gradi celsius e scaldarli a temperatura ambiente per circa tre o cinque minuti fino al disgelo. Spinli giù brevemente in un microfugo.
Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente per circa tre o cinque minuti. Invertire il tubo da due a tre volte per mescolare il reagente e farlo girare brevemente in un microfugo. Trasferire 279 microlitri del tampone di trasfezione a temperatura ambiente in un tubo di microcentrifugo libero RNA e aggiungere 31 microlitri del reagente di trasfezione.
Mescolare accuratamente con pipettazione e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Aggiungere 132 microlitri del tampone di trasfezione a temperatura ambiente all'aliquota di 33 microlitri di MRNA modificata e pipettare delicatamente per mescolare. Aggiungere 102,6 microlitri del tampone di trasfezione a temperatura ambiente all'aliquota di 14 microlitri di MIRNA imita e pipettare delicatamente per mescolare.
Per preparare la miscela di trasfezione di MRNA modificata, aggiungere 165 microlitri del buffer di trasfezione da 310 microlitri, mix di reagenti di trasfezione a 165 microlitri del buffer di trasfezione, mix MRNA modificato. Pipetta da mescolare. Per preparare il mix di trasfezione dei mimici MIRNA, aggiungere 116,6 microlitri del buffer di trasfezione a 310 microlitri, mix di reagenti di trasfezione al buffer di trasfezione da 116,6 microlitri, mix imitazionale MIRNA.
Mescolare bene e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per consentire al tampone di trasfezione di complessità con i MRNA modificati e mimici MIRNA. Rimuovere la piastra con le cellule dall'incubatore a basso ossigeno. Rilascia saggio su ogni pozzo, aggiungi 100 microlitri per pozzo della miscela di trasfezione contenente le MRNA complesse e modificate.
Agitare delicatamente ma accuratamente la piastra con un movimento verso l'alto verso il basso, quindi a sinistra destra per disperdere i complessi di trasfezione. Aggiungere 66,7 microlitri per pozzo della miscela di trasfezione contenente i mimici MIRNA complessi che cadono saggiamente su ogni pozzo. Agitare delicatamente ma accuratamente la piastra con un movimento verso l'alto verso il basso, quindi a sinistra destra per disperdere i complessi di trasfezione.
Posizionare la piastra con le celle trasfette nell'incubatore di tri-gas con basso ossigeno. Disperdere i complessi di trasfezione agitando delicatamente ma accuratamente la piastra con un movimento verso l'alto verso il basso, quindi a sinistra a destra. Incubare le cellule trasfette nell'incubatrice per 16-20 ore prima di cambiare mezzo il giorno successivo.
Aggiungere quattro millilitri di mezzo di riprogrammazione a un tubo conico da 15 millilitri e posizionarlo nell'incubatore basso O due con un tappo allentato per equilibrare durante la notte. La mattina seguente, sostituire il mezzo di trasfezione contenente il mezzo fresco pre-equilibrato integrato con bFGF e B18R e continuare con il regime di trasfezione come descritto nel protocollo. Dopo aver placcato con successo in un pozzo di un piatto di sei ben formato per la riprogrammazione, i fibroblasti sono apparsi molto scarsi.
24 ore dopo la prima trasfezione di successo, i fibroblasti persero la forma del mandrino e adottarono una morfologia più arrotondata. Durante le prime tre trasfettenze, la densità cellulare aumentò gradualmente e costantemente con un apparente scoppio di proliferazione che si verificava tra i sette e gli otto giorni. Al giorno 10, le cellule apparivano in gran parte confluenti.
Le prime colonie ipsc apparvero già il giorno 11. Dai giorni 15 a 17, le colonie IPSC divennero grandi e ovvie e chiaramente distinte dai fibroblasti circostanti e completamente riprogrammati. L'immunosottenzione per il marcatore di pluripotenza TRA-1-60 ha confermato un'elevata efficienza di riprogrammazione.
La densità di placcatura non ottimale è la ragione più comune per ridurre l'efficienza della riprogrammazione in questo protocollo. Se la densità di placcatura era troppo bassa, apparvero grandi macchie di barone acellulare e le colonie IPSC non si formavano. A seguito del passaggio di diluizione delle cellule riprogrammate, gli IPSC crebbero come singole colonie ed erano facilmente distinguibili dai fibroblasti.
Erano vagamente imballati e le singole cellule avevano un'area citoplasmatica relativamente grande. Nel corso di quattro o sette giorni, gli IPSC proliferarono e formarono una caratteristica colonia strettamente imballata con bordi definiti. Le singole cellule all'interno della colonia mostravano una grande frazione nucleare con nucleoli prominenti.
Dopo aver riprogrammato i fibroblasti dei pazienti, gli IPSC risultanti possono essere differenziati in una varietà di cellule somatiche al fine di chiarire i meccanismi che causano la malattia o sviluppare nuove terapie rigenerative a base cellulare.
