I portatori di farmaci polimerici cationici hanno i vantaggi di una buona stabilità, bassa immunogenicità e facile preparazione e modifica. Qui, offriamo un metodo rapido e semplice per la sua sintesi. Il metodo di polimerizzazione reversibile di trasferimento della catena di addizione-frammentazione è un metodo applicabile ai polimeri a blocchi di snervamento con peso molecolare controllato e struttura e che trasportano gruppi funzionali.
Questi portatori di farmaci possono trasportare contemporaneamente diversi farmaci per ottenere il trattamento di collaborazione di cancro, infiammazione e altre malattie. La polimerizzazione IFT è un metodo classico, e questo protocollo fornisce un esempio della sua applicazione nella terapia genica. La chiave del successo per la sintesi di questo polimero è controllare con precisione la temperatura di reazione.
È più consigliabile utilizzare un bagno d'olio che un bagno d'acqua. Per iniziare questa procedura, ottenere un pallone a fondo rotondo con un tappo di gomma e un agitatore magnetico da utilizzare come bottiglia di polimerizzazione. Sciogliere 1,87 grammi di BIS-idrossi HEMA in un millilitro di acqua distillata nella bottiglia di polimerizzazione.
In un bicchiere da cinque millilitri, sciogliere 0,03 grammi di CTP e 0,02 grammi di ACVA in 0,5 millilitri di 1, 4-diossano. Aggiungere questa miscela alla bottiglia di polimerizzazione. Quindi, utilizzare una trappola di condensa per congelare la soluzione nella bottiglia di polimerizzazione.
Fissare la bottiglia al supporto di ferro e utilizzare un condotto inciampato con un ago per aspirare e iniettare azoto nella miscela di reazione. Quindi, sigillare la bottiglia di polimerizzazione e scongelare la soluzione a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere questo ciclo di congelamento-pompa-scongelamento tre volte.
Successivamente, mettere la bottiglia in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius e lasciare che la soluzione reagisca per 24 ore sotto l'atmosfera di azoto. Il giorno successivo, raffreddare la bottiglia di polimerizzazione a zero gradi Celsius e aprire il tappo di gomma per terminare la reazione di polimerizzazione. Successivamente, preraffreddare l'acetone in frigorifero a -20 gradi Celsius per due ore e mescolarlo con la soluzione di reazione nella bottiglia di polimerizzazione con un rapporto di 50 a uno.
Centrifugare questa miscela a 8.200 volte g per 10 minuti per rimuovere l'acetone e raccogliere il precipitato. Per purificare il poli bis-idrossi idrossi HEMA sintetizzato, sciogliere il precipitato raccolto in due millilitri di acqua pura. Quindi, mescolarlo con 100 millilitri di acetone preraffreddato con un rapporto da uno a 50.
Centrifugare la soluzione a 8.200 volte g per 10 minuti per raccogliere il precipitato. Ripetere tre volte questo processo di purificazione della dissoluzione, miscelazione e centrifugazione del precipitato. In primo luogo, sciogliere 0,96 grammi di APMA e 0,93 grammi del poli bis-idrossiere purificato HEMA in cinque millilitri di acqua distillata in un becher da 10 millilitri.
Sciogliere 0,01 grammi di ACVA in 0,5 millilitri da 1, 4-diossano e aggiungerlo alla soluzione APMA e poly bis-idrossi HEMA. Trasferire questa miscela in una bottiglia di polimerizzazione e ventilare con azoto secco per un'ora. Quindi, metti la bottiglia di polimerizzazione in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius e lasciala reagire per 24 ore sotto l'atmosfera di azoto.
Il giorno successivo, raffreddare la bottiglia di polimerizzazione a zero gradi Celsius e aprire il tappo di gomma per terminare la soluzione del processo di polimerizzazione. Per cominciare, seminare cellule MCF-7 nei pozzi di una piastra di sei po 'ad una densità di 20.000 cellule per pozzo. Coltura delle cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 12 ore.
Successivamente, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di coltura fresco contenente polimero cationico e poliplex pDNA di diverso rapporto tra rapporto azoto-fosforo. Coltura delle cellule per sei ore, quindi sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo RPMI 1640 fresco. Continuare a coltivare per 48 ore.
Quindi, raccogliere le cellule e utilizzare un citometro a flusso per rilevare la fluorescenza verde. In questo studio, i copolimeri a blocchi biocompatibili funzionalizzati alla meionina vengono preparati attraverso il metodo reversibile di trasferimento della catena di addizione-frammentazione e viene studiata la capacità di carnagione del DNA plasmide dell'mBG ottenuto e la loro efficienza di trasfezione. La dimensione media delle particelle e il potenziale zeta dei poliplex mBG/pDNA sono 124 nanometri e più 15,7 millivolt, rispettivamente, con un rapporto N-P di 16.
Il ritardo elettroforetico rivela che il pDNA con un rapporto N-P pari a zero può muoversi senza ritegno nel gel di agarosio ed è osservato come una striscia nell'imager del gel. Quando il pDNA è complesso con mBG, il movimento del pDNA è ritardato e, successivamente, la luminosità della banda viene ridotta. Ciò dimostra che mBG può complessare completamente il pDNA quando la N a P è superiore a quattro.
La citotossicità dei poliplex mBG/pDNA viene quindi misurata utilizzando il saggio MTT standard Questi risultati mostrano che i poliplex mBG/pDNA hanno citotossicità rispetto ai polilessi PEI/pDNA ai rapporti N-p di quattro, otto, 16 e 32. Come si può anche vedere, la citotossicità dei polilessi mBG/pDNA aumenta con un aumento del rapporto N-P. Questo aumento della citotossicità è il risultato del componente GPMA caricato positivamente.
Il rapporto N-P utilizzato nell'esperimento di trasfezione del pDNA viene selezionato in base ai risultati della citotossicità. Le capacità di trasfezione di mBG1, mBG2 e mBG3 vengono confrontate misurando l'intensità di fluorescenza della GFP, e i risultati hanno mostrato che mBG3 è il vettore genico ottimale. È importante esaurire l'aria dal pallone a fondo rotondo del limo e mantenere la temperatura di reazione.
I portatori di farmaci polimerici ottenuti possono essere applicati alla co-somministrazione di farmaci chemioterapici e farmaci genetici per trattare sinergisticamente il cancro resistente ai farmaci. Il meccanismo molecolare di combinazione di farmaci genetici e farmaci chemioterapici può essere ulteriormente esplorato per il trattamento di tumori resistenti ai farmaci. L'acetone è classificato come a bassa tossicità per la sua tossicità acuta.
Le chiavi, l'inalazione o il contatto con gli occhi o la pelle devono essere evitati. Evitare il rischio di scottature durante la procedura di riscaldamento.
